ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28066—2011 丁香假单胞杆菌豌豆致病型 检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPseudomonassyringae pv.pisi(Sackett)Youngetal. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前　　言 　　本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人:林石明、黄蓬英、易建平、陈青、廖富荣、吴媛、陈红运、王宏毅。 ⅠGB/T28066—2011 丁香假单胞杆菌豌豆致病型 检疫鉴定方法 1　范围 本标准规定了丁香假单胞杆菌豌豆致病型生物学、血清学及分子生物学的检测鉴定方法。 本标准适用于植物种子、苗木等植物及其产品中丁香假单胞杆菌豌豆致病型的检测和鉴定。 2　丁香假单胞杆菌豌豆致病型基本信息 中文名:丁香假单胞杆菌豌豆致病型。 中文别名:豌豆(细菌性)枯萎病菌或豌豆细菌性叶斑病菌、豌豆假单胞蔓枯病菌或茎枯病菌等。 学名:PseudomonassyringaeVanHall,1902pv.pisi(Sackett,1916)Young,DyeandWilkie,1978。 病害英文名:bactrialblightofpea。 异名:Bacteiumpisi(Sackett)Smith,1920;Chlorobacterpisi(Sackett)Patel&Kulkarni,1951; PseudomonaspisiSackett,1916;PseudomonassyringaeVanHall,1902;Pytomonas(Sackett) Bergey,etal.,1923。 属原核生物界Procaryotes,变形细菌门Proteobacteria,γ-变形细菌纲Gammaproteobacteria,假单 胞杆菌目Pseudomonadales,假单胞杆菌科Pseudomonadaceae,假单胞杆菌属Pseudomonas。 丁香假单胞杆菌豌豆致病型的其他信息参见附录A。 3　方法原理 依据病菌在培养基上生长的菌落形态、碳源的利用情况、基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸 附测定(DAS-ELISA)、基于体外DNA扩增技术的聚合酶链式反应(PCR),以及病菌接种后的致病特征 等进行检测鉴定。 4　主要试剂 本标准的检测鉴定方法主要使用以下试剂: 硫酸镁、磷酸氢二钾、蔗糖、甘油、硼酸、氯化镁、蛋白胨、生理盐水、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、Tris- 盐酸、EDTA、SDS(十二烷基硫酸钠)、CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)、溴化乙锭、头孢氨苄、万古霉素、 头孢呋辛酸、溴酚蓝、放线(菌)酮或制霉菌素和PCR相关试剂。 5　主要仪器 本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器: 超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、培养箱、电子天平、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、 BIOLOG微生物鉴定系统和酶标仪。 1GB/T28066—2011 6　病菌分离 6.1　种子样品的制备 检查皱缩种子和其他为害状的种子。每份种子检测样品至少检测2000粒种子。将种子倒入5L 桶内,加3L无菌水,搅拌,用无菌(新)的塑料袋严密封盖,4℃下静置16h~18h或过夜;去掉塑料袋, 充分搅拌。取种子浸出液10mL,用15000g离心5min,用蒸馏水分2次(每次1mL)洗下沉淀物,制 成种子浸出液,以备分离培养。 6.2　种子中病菌的分离培养 取100μL的种子浸出液涂布于P3和(或)S4培养基平板上(培养基配制见附录B)。每个样品设 3个~10个重复,无菌水作为空白对照。 在25℃±2℃下黑暗中培养,3d后开始观察。 如果在培养基上产生可疑菌落(菌落特征见表1),则将菌落转移至KB平板上划线培养1d~2d进 行纯化(培养基配制见附录B),纯化3次后进行生化鉴定、DAS-ELISA或PCR等方法鉴定。 表1　培养基上的菌落特征 P3培养基 S4培养基 Pspi的菌落扁平状,白色、透明,边缘不规则 Pspi的菌落较大,半球形,白色,边缘整齐 多数菌株有蓝色荧光 — 6.3　植物组织中病菌的分离培养 仔细检查植物叶片、豆荚等组织的症状(参见图A.1),用无菌刀片将可疑的病斑切成细的切块,加 一滴无菌水,置于载玻片上,盖上盖玻片后在显微镜下观察。如果观察到细菌的菌脓,则进行分离培养。 选择新鲜症状的叶片、豆荚等组织,切取病斑前沿部分2mm~7mm的组织,用70%酒精表面消 毒15s,无菌水洗2次~3次,在S4和(或)P3培养基平板上划线分离。 在25℃±2℃下黑暗中培养3d后,开始观察。 如果在培养基上产生可疑菌落(菌落特征见表1),则将菌落转移至KB平板上培养1d~2d进行 纯化,纯化3次后进行生化鉴定、DAS-ELISA或PCR等方法鉴定。 7　病菌鉴定 7.1　生化鉴定 采用BIOLOG微生物鉴定仪对可疑菌落进行生化鉴定。 7.2　DAS-ELISA方法 将可疑菌落配制成104CFU/mL悬浮液,取100μL悬浮液作为检测样品。每个检测样品重复 一次。用已知菌株作阳性对照,用缓冲液作空白对照。 具体操作步骤见附录C。 2GB/T28066—2011 7.3　PCR方法 将可疑菌落制备成108CFU/mL的细菌悬浮液,进行PCR扩增。或者把可疑菌落接种到NB培养 基中(培养基配制见附录B),25℃±2℃下振荡培养过夜,离心后提取沉淀的DNA,进行PCR扩增。 用已知菌株作阳性对照,用无菌水作空白对照。 具体操作步骤见附录D。 7.4　致病性测试 如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR方法中一种或一种以上方法的检测结果产生阳性,则进行致病 性测试以确认鉴定结果。 将豌豆种子播种于小盆钵中,待长出2片~3片真叶的小苗。取在KB培养基上培养24h~48h 的菌落,用消毒的昆虫针蘸取菌落,在最为幼嫩的秸秆处进行刺伤接种。每个菌落接种5株小苗。 5d~7d后,观察是否产生致病性。如果出现扩展型的水渍状病斑,则有致病性;反之,则没有致病性。 注:有些Pspi的菌株在接种1d~2d后,就引起小苗倒伏。 8　结果判定与检测报告 8.1　结果判定 8.1.1　未分离到可疑菌落 如果经S4或P3培养基分离培养,7d后仍未产生可疑菌落,则未检出Pspi。 8.1.2　分离到可疑菌落 分离培养后的可疑菌落,应经生化鉴定、DAS-ELISA或PCR方法检测,并通过致病性测试的确认。 ———如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR检测中一种或一种以上方法的结果产生阳性,致病性测试 也产生典型症状,则判定为检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型; ———如果生化鉴定、DAS-ELISA检测或PCR的结果为阴性,则判定为未检出丁香假单胞杆菌豌豆 致病型; ———如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR检测中一种或一种以上方法的结果为阳性,而致病性测试 为阴性,则应重新进行致病性测试。致病性重新测试后,如果仍然未产生典型症状,则判定为 未检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型。 8.2　检测报告 检测报告应包含所采用检测方法所产生的数据,包括DAS-ELISA检测结果的吸光值数据报告、菌 落形态特征照片、PCR检测的电泳图片或致病性测试结果的照片等。 3GB/T28066—2011 附　录　A (资料性附录) 丁香假单胞杆菌豌豆致病型相关资料 A.1　寄主植物 自然寄主:豌豆(Pisumsativum)、扁豆(Dolichoslablab)、香豌豆(Lathyrusodoratus)和野豌豆 (Viciasepium,V.benghlensis)等。 接种寄主:天蓝苜蓿(Medicagolupulina)、豇豆(V.unguiculata)和菜豆(Phaseolusvulgaris)等。 A.2　传播途径 病菌通过种子进行远距离传播。病菌在种子表面或种子内部至少存活10个月,在田间病残体上存 活几个月,在干燥的种子上可以保持活性3年以上。即使只有0.01%的种子带菌率,也会引起病害发 生,产生严重为害。 病残体也是侵染源。在大田,病菌通过雨水的飞溅、风和人工或机械传带而扩散。 A.3　症状特征 豌豆植株所有的地上部分均会产生症状,包括叶柄、复叶、托叶、茎、卷须、花芽和豆荚,其中在茎秆 和托叶上的症状最为明显。发病严重的田块颗粒无收,一般损失在20%以下。 在干燥且偶有霜冻的天气条件下,症状通常出现在土表的茎部,其上形成水渍状病斑,后期呈橄榄 色至紫褐色。病斑向上发展,侵染复叶和托叶,使叶脉变成褐色至黑色,周围组织发病形成扇形图案,脉 间组织变成水渍状,并逐渐变黄色至褐色,最后叶片干枯呈纸质状。 在多雨的条件,复叶和豆荚上会出现病斑,初期为圆形或卵圆形或不规则的水渍状小斑点,呈暗绿 色;斑点扩大后相互融合成较大的病斑,但是只限于脉间。在病斑表面可能出现乳白色的菌脓,干燥后 有亮光。 在叶片和托叶上,最初症状为小的、暗绿色水渍状病斑。病斑经常扩展并融合,但是均会受到叶脉 的限制。在小叶上,病斑发黄,后变褐色,而呈薄纸状。复叶后期变黄,病斑呈褐色纸状。 茎秆上的病斑向托叶和小叶扩展,在托叶上产生伞形病斑。受侵染的叶脉变黑褐色,叶片组织变成 黄色至褐色,干枯后变薄纸状结构。茎秆上的病斑可能融合,引起萎缩死亡。 在果荚上,病斑凹陷,橄榄褐色;在近土表的茎秆上