ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28064—2011 蚕 豆染色病毒检疫鉴定方法 Detectionandidentificationofbroadbeanstainvirus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国深圳出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:陈红运、陈青、林石明、郑耘、赵文军、李一农、廖富荣、余芳平、朱水芳、陈枝楠。 ⅠGB/T28064—2011 蚕豆染色病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了蚕豆染色病毒的血清学和分子检测方法。 本标准适用于蚕豆Viciafaba、小扁豆Lensculinaris、豌豆Pisumsativum和菜豆Phaseolus vulgaris种子携带蚕豆染色病毒的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 蚕豆染色病毒基本信息 中文名:蚕豆染色病毒。 学名:broadbeanstainvirus。 缩写:BBSV。 属豇豆花叶病毒科Comoviridae;豇豆花叶病毒属Comovirus。 病株花粉可通过授粉将病毒传至健株种子;远距离通过种子传播,种传寄主有蚕豆(种传率4%~ 16%)、豌豆(20%)和小扁豆(0.2%~32.4%)。BBSV易机械接种传播,并可通过甲虫传毒,豆长喙象 甲Apionvorax是最主要的传毒介体。 蚕豆染色病毒的其他信息参见附录A。 4 方法原理 主要根据BBSV的血清学特性和基因组特征进行鉴定,生物学测定为辅助鉴定手段。 5 仪器、设施及试剂 5.1 仪器与设施 酶联检测仪、电子天平(感量0.0001g)、定性PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、恒温水浴、低 温冰箱、普通冰箱、离心机等;微量移液器(2.5μL,10μL,20μL,100μL,200μL,1000μL);酶联板、研 钵等;防虫温室。 5.2 试剂 酶联免疫吸附测定试剂(见附录B)、RT-PCR检测试剂(见附录C)。 1GB/T28064—2011 6 检测与鉴定 6.1 抽样 按照SN/T2122的规定执行。 6.2 制样 选取种皮呈BBSV为害症状的可疑病粒,无可疑病粒时随机选取。用无菌水浸种16h,磁盘中放 入两层吸满水的滤纸,将充分吸水的种子摆放在滤纸上,20℃催芽,芽长2cm~4cm时取芽进行检测。 检测方法见6.3。 注:资源性引种时,每份资源选10粒~14粒种子播种于防虫温室或网室内,待长出4片~6片叶时挑选有病毒症 状植株的叶片进行检测。 6.3 检测 6.3.1 酶联免疫吸附测定 双抗体夹心法见附录B。 6.3.2 RT-PCR检测 称取0.1g植物组织提取总RNA,沉淀充分干燥后溶于30μLDEPC处理的去离子水中。 RT-PCR检测方法见附录C。 6.3.3 生物学测定 生物学测定参见附录D。 7 结果判定与记录 7.1 结果判定 酶联测定为阳性后,RT-PCR检测结果呈阴性或者鉴别寄主反应与附录D描述不符合,判定未检 出蚕豆染色病毒。 酶联测定为阳性后,RT-PCR检测结果呈阳性或者鉴别寄主反应与附录D描述相符合,判定检出 蚕豆染色病毒。 直接对样品进行RT-PCR检测时,检测结果呈阳性即可判定检出蚕豆染色病毒。 7.2 结果记录 记录包括:样品来源、种类、取样人员、原始记录和检测结果等。酶联测定应有酶联板反应的原始数 据,RT-PCR检测应有电泳结果图片,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。 8 样品保存 经检验确定携带蚕豆染色病毒的样品应在合适的条件下保存,种子保存在4℃,病株在-20℃或 者-80℃冰箱中保存,做好标记和登记工作。 2GB/T28064—2011 附 录 A (资料性附录) 蚕豆染色病毒寄主、分布及危害症状 A.1 寄主范围 BBSV侵染7种豆科植物:美丽猪屎豆(Crotalariaspectabilis)、毛羽扇豆(Lupinushirsutus)、白花 草木犀(Melilotusalba)、菜豆、豌豆、绛车轴草(Trifoliumincarnatum)和蚕豆。 A.2 病害症状 A.2.1 蚕豆 蚕豆感染BBSV后,症状分为花叶型和坏死型。花叶型表现为接种叶片上有或无局部斑,新叶均 呈褪绿条纹状、环状和块状花叶片上出现褪绿斑驳和花叶症状;坏死型表现为接种叶片有或无黄化或局 部斑,叶脉和茎出现坏死条纹,最后茎坏死、顶枯、全株萎蔫。种子表皮出现褐色坏死色斑。 A.2.2 豌豆 豌豆感染BBSV后,症状分为花叶型、顶枯型和花叶、顶枯混合型。花叶型先在新叶出现系统褪绿 点,后发展为花叶、畸形;顶枯型在茎上出现系统褐色或坏死条纹,后顶梢枯死。 A.2.3 菜豆 豌豆感染BBSV后,症状分为局部斑和系统斑。局部斑是在接种叶上产生局部坏死斑或先为局部 褪绿斑而后病斑中心坏死,系统斑不但在接种叶上有坏死斑,新生叶还出现系统枯斑。 A.2.4 小扁豆 小扁豆感染BBSV后,症状不明显或很长时间才有症状反应,有些品种出现死株,有些品种接种后 25d才见新叶上出现不明显花叶。因此小扁豆不适合作繁殖寄主或鉴别寄主。 A.3 分布地区 英国、法国、德国、瑞典、捷克、奥地利、波兰、匈牙利、意大利、叙利亚、黎巴嫩、苏丹、摩洛哥、埃及和 突尼斯等欧洲、西亚和北非国家。 3GB/T28064—2011 附 录 B (规范性附录) 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 B.1 试材 B.1.1 酶联板。 B.1.2 包被抗体:特异性的蚕豆染色病毒抗体。 B.1.3 酶标抗体:碱性磷酸酯酶标记的蚕豆染色病毒抗体。 B.1.4 底物:对硝基苯磷酸二钠(ρNPP)。 B.1.5 PBST缓冲液(洗涤缓冲液pH7.4) NaCl 8.0g Na2HPO4 1.15g KH2PO4 0.2g KCl 0.2g Tween-20 0.5mL 蒸馏水定容至1L。 B.1.6 样品抽提缓冲液(pH7.4) Na2SO3 1.3g PVP(MW24000~40000) 20.0g NaN3 0.2g PBST定容至1L,4℃储存。 B.1.7 包被缓冲液(pH9.6) Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.93g NaN3 0.2g 蒸馏水定容至1L,4℃储存。 B.1.8 酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4) BSA(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉 2.0g PVP(MW24000~40000) 20.0g NaN3 0.2g PBST定容至1L,4℃储存。 B.1.9 底物(ρNPP)缓冲液(pH9.8) MgCl2 0.1g NaN3 0.2g 二乙醇胺 97mL 溶于800mL蒸馏水中,用HCl调pH值至9.8,蒸馏水定容至1L。4℃储存。 B.2 程序 B.2.1 包被抗体 用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加入酶联板的孔中,100μL/孔,37℃孵育2h,清空孔中溶液, PBST洗涤3次。 4GB/T28064—2011 B.2.2 样品制备 待测样品按1∶10(质量∶体积)加入抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,7500g离心10min,上清液即 为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行;空白对照为样品抽提缓 冲液。 B.2.3 加样 根据检测需要设计96孔(或48孔)酶联板,包括2个阴性对照孔、2个阳性对照孔、2个空白对照孔 和多个待测样品孔。加样量为100μL/孔,每个样品设1个重复。4℃冰箱孵育过夜,酶联板用PBST 洗涤3次。 B.2.4 加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,并加入到酶联板中,100μL/孔,37℃ 孵育4h,PBST洗涤3次。 B.2.5 加底物 将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),按100μL/孔,加入到酶联板 中,室温避光孵育。 B.2.6 读数 用酶标仪在30min、1h和2h于405nm处读OD值。 注:实际检测时,PBST洗涤次数和显色读数时间需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。 B.3 结果判断 B.3.1 对照孔的OD405值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内,即: 缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值<0.15; 阳性对照OD405值/阴性对照OD405值>2; 同一样品的OD405值应基本一致。 B.3.2 在满足了B.3.1质量要求后,结果原则上可判断如下: 样品OD405值/阴性对照OD405值>2,判为阳性; 样品OD405值/阴性对照OD405值接近阈值,判为可疑样品,需重做一次或用其他方法验证; 样品OD405值/阴性对照OD405值<2,判为阴性。 B.3.3 若满足不了B.3.1质量要求,则不能进行结果判断。 注:质量控制标准和结果判定需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。 5GB/T28064—2011 附 录 C (规范性附录) RT-PCR检测 C.1 试剂 C.1.1 TrizoL裂解液。 C.1.2 三氯甲烷。 C.1.3 异丙醇。 C.1.4 75%乙醇。 C