ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28063—2011 菜 豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法 Detectionandidentificationofbeanpodmottlevirus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:廖富荣、沈建国、郑耘、陈青、林石明、陈红运、黄蓬英、吴媛。 ⅠGB/T28063—2011 菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了菜豆荚斑驳病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法。 本标准适用于可能携带该病毒的豆科作物的种子、苗木等植物繁殖材料的检测鉴定,也适用于传播 该病毒介体昆虫的检测鉴定。 2 菜豆荚斑驳病毒基本信息 中文名:菜豆荚斑驳病毒。 英文名:beanpodmottlevirus。 异名:beanpodmottlecomovirus(菜豆荚斑驳病毒),podmottlevirus(荚斑驳病毒),desmodium virus(金钱草病毒)。 英文缩写:BPMV。 属豇豆花叶病毒科Comoviridae、豇豆花叶病毒属Comovirus。 菜豆夹斑驳病毒的其他信息参见附录A。 3 方法原理 利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、反转录和体外DNA扩增技 术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行检测鉴定。 4 主要仪器设备 本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备: 微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平(感量:0.001g)、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳 槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计和各种量程的可调移液器(1000μL、200μL、 100μL、20μL、2μL)。 5 检测样品的制备 5.1 DAS-ELISA和IC-RT-PCR检测样品的制备 对每批送检样品进行症状检查,优先选取具有褐色或黑色斑驳症状的种子(从种脐开始),或者选取 具有斑驳、皱缩、褪绿等症状的叶片。 种子样品:称取0.5g~1.0g的种皮作为检测样品,在液氮中充分研磨,回温后按1∶10比例加入 样品提取缓冲液继续研磨。 叶片样品:称取0.5g~1.0g的叶片作为检测样品,在研钵中研磨或在液氮中研磨,按1∶10比例 加入样品提取缓冲液继续研磨。 把研磨后的样品转移到5mL离心管中,8000r/min离心5min,上清液作为DAS-ELISA(见附 录B)和IC-RT-PCR(见附录C)检测提取液。 注:提取液在3h内使用,否则保存在4℃中。 1GB/T28063—2011 5.2 RT-PCR检测样品的制备 称取表现症状的0.1g叶片、种子等样品在液氮中充分研磨后,利用TRIzol方法提取RNA。(见 附录D中的D.3) 6 检测与鉴定 6.1 检测鉴定流程 通常,初筛时采用DAS-ELISA检测方法。当DAS-ELISA产生阳性结果时,再采用IC-RT-PCR 或RT-PCR等方法进行验证。 当首先采用IC-RT-PCR或RT-PCR方法检测时,如果产生阳性结果,则通过实时荧光RT-PCR方 法或序列测定等方法验证。 6.2 DAS-ELISA检测 把制备的样品上清液加入已包被BPMV抗体的在96微孔板中,进行DAS-ELISA检测,每个样品 平行加到两个孔中。用健康的植物组织作阴性对照,用感染BPMV的植物组织作阳性对照,用样品提 取缓冲液作空白对照,其中阴性对照种类和材料(如:种子或叶片)应该尽量与所检测样品相一致。 具体操作过程见附录B。 6.3 RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后,进行PCR扩增。用健康的植物组织作阴性 对照,用感染BPMV的植物组织作阳性对照,用超纯水作空白对照。 具体操作过程见附录D。 6.4 IC-RT-PCR检测 把制备的样品上清液加入已包被BPMV抗体的离心管中,然后进行RT-PCR扩增。用健康的植 物组织作阴性对照,用感染BPMV的植物组织作阳性对照,用超纯水作空白对照。 具体操作过程见附录C。 6.5 序列测定 将PCR产物回收后,进行克隆、测序,或者直接测序,测序可由生物公司完成。把测序所得到的核 苷酸序列翻译成氨基酸后与已知的BPMV相应序列进行比对,如果与已知的BPMV相应序列同源性 大于75%则判定为BPMV序列,同源性小于75%则判定为非BPMV序列。 注:序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行,网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 7 结果判定与报告 7.1 结果判定 当产生以下检测结果时,则判定为检出BPMV: ———当DAS-ELISA检测、IC-RT-PCR(或RT-PCR)检测、其中两种方法的检测结果呈阳性时,则 判定为检出BPMV; 2GB/T28063—2011 ———当IC-RT-PCR或RT-PCR检测结果呈阳性,测定的序列为BPMV序列时,则判定为检出 BPMV。 7.2 结果记录与保存 记录各项实验数据,包括样品种类、来源,检测时间、地点、方法和结果等。DAS-ELISA检测结果 保存吸光值的数据报告,IC-RT-PCR或RT-PCR检测结果保存电泳照片,序列测定结果保存测序报 告图。 3GB/T28063—2011 附 录 A (资料性附录) 菜豆荚斑驳病毒简介 A.1 分布地区 北美洲:美国、加拿大。 南美洲:巴西、厄瓜多尔、秘鲁。 亚洲:伊朗。 A.2 形态特征 病毒粒子形态为等轴对称二十面体,无包膜,直径为28nm。 A.3 寄主范围及症状 BPMV的寄主局限于豆科植物,主要是大豆(Glycinemax)和菜豆(Phaseolusspp.),山蚂蟥 (Desmodiumpaniculatum)是其多年生寄主。 在鉴别寄主植物上的症状: 大豆(Glycinemax):表现为严重的系统症状,叶片斑驳、皱缩、荚和种子斑驳,甚至坏死、植株死 亡。该病毒还能延迟大豆茎杆成熟,引起“绿茎”现象。在种子上产生褐色、黑色的斑驳症状,症状从种 脐开始,因而称为“种脐渗色”。 菜豆(Phaseolusvulgaris)Tendergreen品种:起初出现褪绿斑,后发展为严重的系统褪绿,叶片畸 形,豆荚严重斑驳、深绿色、豆荚变短、畸形、扭曲、变得粗糙有疣状突起。 菜豆(P.vulgaris)Pinto品种:无系统症状,接种后约3d~4d出现散生的红色局部枯斑,接种叶 有时叶脉坏死。 菜豆(P.vulgaris)Bountiful品种:无系统症状,接种后约3d~4d出现大的淡黄色局部病斑。 A.4 传播途径 BPMV可以通过昆虫介体传播,主要是大豆叶甲(Cerotomatrifurcata),而玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)、带斑黄瓜叶甲(D.balteata)、点斑黄瓜叶甲(D.undecimpunctatahowardii)、葡萄甲虫(Co- laspisflavida)、甲虫(C.lata)、曲条豆芫菁(Epicautavittata)、墨西哥叶甲(Epilachnavarivestis)和大 豆潜叶虫(Odontotahorni[Xenochalepushorni])也是该病毒的传播介体。 该病毒另外还可以机械传播,嫁接传播,以及通过种子进行远距离传播。从感染BPMV植株上收 获的种子,其种传率为0.10%,种传率相对较低。与大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus,SMV)一起 感染,种传率可以达到39%。 A.5 血清学特性 BPMV具有很强的免疫原性,制备的多克隆抗体可以检测大豆叶片、种子、草本寄主植物和介体昆 虫中的病毒。 4GB/T28063—2011 A.6 分子生物学特性 BPMV是正链RNA病毒,其基因组由两条正链RNA-1(约3.6kb)和RNA-2(约6.0kb)组成,分 别包裹在两个直径为28nm的等轴多面体粒体中。RNA-1编码5个复制所需的蛋白,RNA-2编码一 个推导的细胞间运动蛋白和两个外壳蛋白。 A.7 豇豆花叶病毒属种间区分依据 A.7.1 大外壳蛋白(Largecoatprotein,LCP)的氨基酸序列同源性小于75%。 A.7.2 聚合蛋白酶的氨基酸序列同源性小于75%。 A.7.3 在可能的成分间没有假重组。 A.7.4 抗原反应有差异。 5GB/T28063—2011 附 录 B (规范性附录) DAS-ELISA检测操作步骤 B.1 DAS-ELISA所采用的试剂 B.1.1 包被缓冲液(pH9.6) 碳酸钠(Na2CO3) 1.59g 碳酸氢钠(NaHCO3) 2.93g 叠氮化钠(NaN3) 0.20g 加入900mL蒸馏水溶解,用HCl调节pH值到9.6,然后加水至1L。 B.1.2 磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4) 氯化钠(NaCl) 8.0g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.2g 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 1.15g 氯化钾(KCl) 0.2g 叠氮化钠(NaN3) 0.2g 加入900mL蒸馏水溶解,用NaOH或HCl调节pH值到7.4,然后加水至1L。 B.1.3 PBST 每升PBS中加入0.5mL的Tw