ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28062—2011 柑 桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法 DetectionofCandidatusLiberibacterasiaticususingthe real-timefluorescentPCR 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:重庆大学、农业部农业技术推广服务中心、中华人民共和国北京出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人:殷幼平、王中康、王玉玺、高文娜、夏玉先、曹月青、彭国雄、李正国。 ⅠGB/T28062—2011 柑桔黄龙病菌实时荧光PCR检测方法 1 范围 本标准规定了柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌(CandidatusLiberibacterasiaticus)实时荧光PCR检测的 样品制备、检测操作方法及结果判定标准。 本标准适用于对芸香科和非芸香科植物罹病植株和传播媒介柑桔木虱中黄龙病亚洲韧皮杆菌的检 测和病害鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB5040 柑桔苗木产地检疫规程 GB/T19495.2 转基因产品检测实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 柑桔黄龙病 CitrusHuanglongbing 一种由韧皮杆菌引起的植物检疫性病害。主要侵染柑桔属、金柑属和枳属等柑桔类植株重。由带 菌种苗远距离传播,田间主要由柑桔木虱取食传播。典型受害植株叶片斑驳不均匀黄化,枝梢黄化,果 实畸形,种子败育,严重时可引起植株死亡。 3.2 实时荧光PCR real-timefluorescentPCR 实时荧光聚合酶链式反应,一种在体外扩增微量的特殊DNA片段的方法,在扩增过程中由于荧光 物质的释放或荧光物质与扩增产物结合并被实时检测而能够快速、灵敏地检出模板DNA的存在。 3.3 扩增引物 primer 人工合成的寡核苷酸序列,其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同,用于引导DNA体外 扩增。 3.4 扩增模板 templet DNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列。 3.5 Ct值 cyclethresholdvalue 实时荧光PCR反应中每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.6 亚洲韧皮杆菌重组质粒DNA recombinantplasmidDNA 利用特异性引物扩增柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌基因组模板,获得的亚洲韧皮杆菌特异性DNA扩 1GB/T28062—2011 增序列,经构建重组质粒、转入大肠杆菌JM109菌株中繁殖培养后,重新提取获得的质粒DNA。用于 作为柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌实时荧光PCR检测的阳性对照。 4 柑桔黄龙病菌基本信息 学名:亚洲韧皮杆菌 CandidatusLiberibacterasiaticus。 病害名称:柑桔黄龙病,常用英文名:CitrusHuanglongbing。 分类地位:α-朊细菌亚纲、根瘤细菌目(Rhizobiales),根瘤细菌科(Rhizobiaceae),韧皮杆菌属 Liberibacter的G-细菌。是一种难培养细菌。 引起柑桔黄龙病的韧皮杆菌根据其核糖体基因序列的差异可以分为3种,即分布于非洲的柑桔黄 龙病非洲韧皮杆菌CandidatusLiberibacterafricanus,分布于南美洲的柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌Can- didatusLiberibacteramericanus和分布于亚洲及北美的柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌CandidatusLiberi- bacterasiaticusJagoueixetal。 柑桔黄龙病菌其他信息参见附录A。 本标准规定了对亚洲韧皮杆菌的检疫鉴定方法。对来自于非洲的柑桔材料的检疫检验,可参见附 录B检测柑桔黄龙病非洲韧皮杆菌;对来自美洲的柑桔材料,除利用本标准检测柑桔黄龙病亚洲韧皮 杆菌外,可参见附录C检测柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌。 5 方法原理 本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法。其原理是,利用 病菌特有DNA序列设计引物,在PCR扩增时加入荧光染料,荧光染料与扩增形成的产物-DNA双链结 合而发出荧光被检测器实时检测(荧光染料法),或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双 标记探针,探针5’端和3’端分别标记荧光素报告基团和淬灭基团,如果反应体系中存在待测目标DNA 模板,引物和探针则与模板上的序列配对而特异性结合,当PCR扩增延伸到探针结合部位时,Taq DNA聚合酶将探针水解成单核苷酸,使标记在探针上的报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实 时检测(荧光探针法)。由于初始模板量的不同,反应管内的荧光物质达到设定的可检测阈值时所经历 的Ct值不同,因此Ct值可以用于判定检测样品的初始菌量。 6 实验室设置 参照GB/T19495.2。实验室应至少分为三个相对独立的工作区域:样本制备区、反应试剂配制区 和检测区;每个工作区域应有明确标记,避免不同工作区域内的设备、物品混用。 7 主要仪器设备和试剂 7.1 仪器设备 7.1.1 实时荧光PCR仪。 7.1.2 高速台式离心机。 7.1.3 生物安全柜或超净工作台。 7.1.4 冰箱(冷藏室4℃和冷冻室-20℃)。 7.1.5 涡旋混匀仪。 7.1.6 紫外灭菌灯。 2GB/T28062—2011 7.1.7 微量可调移液器(0.5μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL)。 7.1.8 带滤芯Tip头。 7.1.9 PCR反应管(0.2mL八联管)。 7.1.10 微滤柱。 7.1.11 高压灭菌锅。 7.2 试剂 7.2.1 次氯酸钠(NaClO3)。 7.2.2 十二烷基硫酸钠(SDS)。 7.2.3 蛋白酶K(ProteinaseK)。 7.2.4 三羟甲基氨基甲烷(Tris)。 7.2.5 乙二胺四乙酸(EDTA)。 7.2.6 盐酸胍(GuanidingeHCl)。 7.2.7 无水乙醇(ethanol)。 7.2.8 实时荧光PCR混合试剂(Real-timePCRMasterMix)。 8 取样及样品处理 8.1 取样用具 8.1.1 样品袋:牛皮纸袋或信封(一次性使用)。 8.1.2 枝剪。 8.1.3 剪刀,镊子,打孔器。 8.1.4 研钵。 8.1.5 塑料离心管(1.5mL)。 8.1.2~8.1.5的取(制)样用工具应经121℃±2℃,15min高压蒸汽灭菌。田间采样每个样品采 集后或实验室处理每个不同样品后,工具应用70%酒精棉球擦拭2次以上,以避免样品间相互污染。 8.2 取样方法 8.2.1 实地取样 产地检疫田间实地取样参照GB5040。 8.2.2 叶片样品 疑似病树按树冠东南西北四方采集,每点取中下部成熟叶片各5片,每棵树共采集叶片20张。 种苗抽取显现疑似症状植株或随机抽取植株(无症材料)10株,每株取中下部成熟叶片5片,共 50片。 接穗等繁殖材料按规程规定的比例抽取样品。 黄龙病病害症状及疑似症状详参见附录D。 8.2.3 果实样品 幼果期采样,切取果柄和果蒂,每样品采集4份;商品鲜果每批果实随机抽取10个果实,切取果柄 和果蒂。 3GB/T28062—2011 8.2.4 传病媒介柑桔木虱 在柑桔新梢抽发期,每株树采集1头~10头成虫,每园采集50头以上;口岸或调运种苗、接穗等材 料中发现的木虱则直接收集。用75%乙醇浸泡固定30min。放入1.5mL离心管封装。 样品采集后立即装入样品袋(木虱用75%乙醇杀死固定后装入微量离心管),并按照要求填写采样 记录,记载样品来源、样品品种、目测症状、采样人、采样地、采样时间等,及时送指定检测实验室。 8.3 样品贮运与保存 采集的植株样品按上面要求用样品袋分装,乙醇固定的柑桔木虱控干乙醇后用塑料离心管分装,与 采集记录一并寄送指定实验室检测。检测后余下的植物材料可置于4℃条件下保存7d,以备复测的需 要。不需保存的样品应立即进行无害化灭菌处理以防止病害扩散。 8.4 样品DNA制备操作(在检测实验室样品制备区进行) 样品DNA制备在检测实验室样品制备区进行。制备好的DNA样本在4℃条件下保存应不超过 7d,在-20℃冻存不超过30d,避免反复冻融。 样品DNA制备的具体操作过程见附录E。 9 PCR扩增 PCR扩增反应体系为25μL。准备PCR扩增反应管,分别加入反应液23μL,最后加入制备的待测 样品DNA2μL。每个样品设置3次重复。每次PCR检测应设立相应的阳性对照、阴性对照和空白 对照。 扩增过程中,设置在每次循环的延伸阶段采集荧光。 荧光染料法检测须在扩增结束后立即进行熔解曲线分析,以验证扩增的特异性。熔解曲线的反应 程序为:95℃,1min;55℃,1min;然后从55℃开始每升高0.5℃保持10s,连续升高80次(到95℃ 为止)。 检测结束后,根据采集的荧光曲线和Ct值判定结果。 PCR扩增的准备及扩增具体操作过程见附录F(使用不同PCR仪具体扩增程序参数可能稍有 调整)。 推荐使用柑桔黄龙病菌亚洲种实时荧光PCR检测试剂盒。试剂盒组成、功能及使用注意事项参见 附录G。 10 结果判定与表述 10.1 结果分析条件设定