ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27982—2011 小 反刍兽疫诊断技术 Diagnostictechniquesforpestedespetitsruminants 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:农业部热带亚热带动物病毒学重点实验室、中国动物卫生与流行病学中心、中国 检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:包静月、吴晓东、王志亮、李林、刘春菊、王清华、赵文姬、邹艳丽、郑东霞、徐天刚、 李金明、姚李四、张乐、林祥梅、吴绍强、韩雪清。 ⅠGB/T27982—2011 小反刍兽疫诊断技术 1 范围 本标准规定了小反刍兽疫的临床诊断和实验室诊断的技术要求。 本标准适用于小反刍兽疫的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489—2008 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 荧光定量反转录-聚合酶链式反应 realtimequantitativereversetranscriptionpolimerasechainre- action 荧光定量RT-PCR反应 在RT-PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程,最后通过 标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 3.2 荧光域值 threshold 荧光定量RT-PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是 3个~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 3.3 Ct值 Ctvalue 每个反应管内的荧光信号到达设定的荧光域值时所经历的循环数。 4 生物安全措施 进行小反刍兽疫实验室检测时,如病毒分离、血清处理等,按照GB19489—2008。 5 临床诊断 5.1 临床症状 5.1.1 突然发热,第2天~第3天体温达40℃~42℃高峰。发热持续3d左右,病羊死亡多集中在发 热后期。 1GB/T27982—2011 5.1.2 眼、鼻大量排出分泌物,最初水样的眼、鼻分泌物日益增多,变成脓性然后结干,动物发出恶臭。 由于鼻孔被凸起的结干的鳞屑覆盖,动物打喷嚏和咳嗽。呼吸急促,呼吸困难,排痰性咳嗽和眼睛的卡 他性分泌物。 5.1.3 口腔粘膜充血,口腔上皮和鼻腔粘膜出现大量部分粘连的极微小的略灰色坏死点,坏死组织脱 落后形成界线分明的浅糜烂斑。上皮破损偏好部位为嘴唇、齿龈、牙板、舌头以及母羊阴户的阴唇表面。 口腔破损可能伴有大量流涎。 5.1.4 发热2d~3d后病畜开始腹泻,伴随严重脱水、消瘦、虚脱。怀孕母羊可发生流产。 5.1.5 特急性病例在发热开始的4d~6d内死亡。亚临床型病例症状较轻,病畜在生病10d~14d 以后康复。 5.2 病理变化 5.2.1 嘴唇充血,口腔破损程度不等,较轻的只有一处溃疡,严重的出现广泛的溃疡性及坏死性口腔 炎,涉及牙板、硬腭、颊粘膜和乳突和舌头喙部背面。粘膜病变可延伸至咽部,偶尔在网胃和瘤胃交 界处。 5.2.2 上呼吸道粘膜可能严重充血,伴有鼻孔和气管的溃疡。支气管肺炎,肺尖肺炎。 5.2.3 皱胃粘膜出现严重的充血和溃烂。偶尔,整个肠道出现弥散性的充血,但是,多数情况仅局限于 十二指肠、回肠、盲肠和结肠上部分。常见回盲肠瓣膜出血。大肠纵向折叠顶部偶尔出现严重的出血形 成斑马样条纹。 5.2.4 肠淋巴组织坏死、萎陷。肠系膜淋巴组织轻微肿大、水肿,脾可能肿胀。上呼吸道粘膜可能严重 充血,伴有鼻孔和气管的溃疡。支气管肺炎,肺尖肺炎。肺部淋巴结肿胀并水肿。 5.2.5 结膜出现脓性结膜炎。肾和膀胱可见充血。母羊可见阴户和阴道糜烂。 5.2.6 组织学上可见肺部组织出现多核巨细胞以及细胞内嗜酸性包含体。 5.3 结果判定 山羊或绵羊出现上述临床症状和病理变化,羊群发病率、病死率较高,传播迅速,可判定为疑似小反 刍兽疫。 6 实验室诊断 6.1 样品采集与运输 6.1.1 样品的采集 6.1.1.1 每个发病羊群最少选择5只病畜采集样品。 6.1.1.2 选择处于发热期(体温40℃~41℃)、排出水样眼分泌物、出现口腔溃疡、无腹泻症状的活畜 采集样品。采集结膜棉拭子2个、鼻粘膜棉拭子2个、颊部粘膜棉拭子1个,分别放在300μL灭菌的 0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中。无菌采集血液10mL,用常规方法分离血清。 6.1.1.3 选择刚被扑杀或者死亡时间不超过24h的病畜采集组织样品。无菌采集肠系膜和支气管淋 巴结各3个~4个,脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织各约25g~50g,分别置于50mL离心管中。 6.1.1.4 肉制品取25g~50g,置于50mL离心管中。 6.1.2 样品的运输与储存 6.1.2.1 样品采集后,置冰上冷藏送至实验室检测。 6.1.2.2 血清储存应置于-20℃冰箱。 2GB/T27982—2011 6.1.2.3 棉拭子、病料组织和肉制品储存应置于-70℃冰箱。 6.2 器械与设备 5%二氧化碳培养箱,DNA热循环仪,低温高速离心机,电泳仪和电泳槽,凝胶成像系统或者紫外检 测仪,实时荧光定量PCR仪,96孔高吸附性酶标板,洗瓶或者洗板机,恒温箱,酶标仪。 6.3 病毒分离与鉴定 6.3.1 试验材料 非洲绿猴肾(Vero)细胞,pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)(见A.1),细胞培养液(见A.3),细胞培 养瓶。 6.3.2 样品处理 棉拭子充分捻动、挤干后弃去拭子,加入青霉素至终浓度200IU/mL,加入链霉素至终浓度 200μg/mL。37℃作用1h。3000g离心10min,取上清液300μL作为接种材料。 用灭菌的剪刀、镊子取大约0.5g组织样品或肉制品,置于研钵中,剪碎,充分研磨,加入5mL灭菌 的0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液(含青霉素200IU/mL,链霉素200μg/mL),制成1∶10悬液。 37℃作用1h。3000g离心10min,取上清液5mL作为接种材料。 不能立即接种者,应将上清放-70℃保存。 6.3.3 样品接种 取样品上清液接种已长成单层的Vero细胞,37℃恒温箱中吸附2h,加入细胞培养液,置5%二氧 化碳培养箱37℃培养。 6.3.4 观察结果 接种后5d内,细胞应出现细胞病变效应,表现为细胞融合,形成多核体。如接种5d~6d后不出 现细胞病变,应将细胞培养物盲传三代。 6.3.5 病毒的鉴定 将出现细胞病变的细胞培养物,按“6.4 RT-PCR方法”和“6.5 荧光定量RT-PCR反应”做进一 步鉴定。 6.3.6 结果判定 样品出现细胞病变,而且RT-PCR方法或实时荧光RT-PCR方法鉴定结果阳性,则判为小反刍兽 疫病毒分离阳性,表述为检出小反刍兽疫病毒。 否则,表述为未检出小反刍兽疫病毒。 6.4 RT-PCR方法 6.4.1 试剂与材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。 TRIzol试剂,三氯甲烷,异丙醇,无水乙醇,DEPC处理过的水(见附录B),反转录酶/TaqDNA聚 合酶混合液,2×一步法RT-PCR反应缓冲液,1.5%的琼脂糖凝胶(见附录B),0.5×TBE缓冲液(见附 录B),溴化乙锭。 3GB/T27982—2011 可以采用引物NP3/NP4用于小反刍兽疫病毒核酸的检测,引物的靶基因、位置、序列和扩增产物 的大小见表1。 表1 用于小反刍兽疫病毒RT-PCR检测的引物 引物 目的 靶基因 序列(5′–3′) 产物 NP3 正向引物 N基因 TCTCGGAAATCGCCTCACAGACTG 351bp NP4 反向引物 N基因 CCTCCTCCTGGTCCTCCAGAATCT 6.4.2 样品处理 将棉拭子充分捻动、挤干后弃去拭子,取100μL样品液至一新的离心管中,加入1mLTRIzol试 剂,振荡混匀,进行RNA提取。 取大约100mg组织样品,剪碎后,加入1mLTRIzol试剂充分匀浆后转移至1.5mL离心管中,进 行RNA提取。 6.4.3 RNA提取 经TRIzol处理的样品液12000r/min,4℃离心10min,取上清,静置5min。加200μL三氯甲 烷,振荡混匀,15s,静置2min~3min。12000r/min,4℃离心15min,取400μL上层水相到新的离 心管中,加400μL的异丙醇,混匀,静置10min。12000r/min,4℃离心10min,去上清。加入75%乙 醇1mL,混匀,12000r/min,4℃离心5min,去上清。再加入75%乙醇1mL,混匀,12000r/min,4℃ 离心5min,去上清。干燥RNA沉淀后加入100μLDEPC处理过的水溶解。立即进行RT-PCR反应 或-70℃保存。 6.4.4 RT-PCR反应 反应体系为25μL,依次加入以下成分:12.5μL2×一步法RT-PCR反应缓冲液,1μL正向引物 NP3(10μmol/L),1μL反向引物NP4(10μmol/L),1μL反转录酶/TaqDNA聚合酶混合液,4.5μL DEPC处理过的水,5μLRNA模板。 每次进