ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27981—2011 牛 传染性鼻气管炎病毒实时 荧光PCR检测方法 Real-timePCRmethodforthedetectionof infectiousbovinerhinotracheitisvirus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准参考了OIE发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》(2008版)关于牛传染性鼻气管炎/牛传 染性化脓性外阴阴道炎(Chapter2.4.13)的内容。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人:陈茹、刘中勇、林志雄、罗琼、曾碧健、许如苏、姜焱、吴晓薇。 ⅠGB/T27981—2011 牛传染性鼻气管炎病毒实时 荧光PCR检测方法 1 范围 本标准规定了牛传染性鼻气管炎病毒(牛疱疹病毒I型,BoHV-1)实时荧光PCR检测方法的技术 要求。 本标准适用于快速检测牛血样、拭子、精液、动物组织(粘膜、肝、脾、肾、淋巴结、胎盘组织等)和细胞 培养物等样品中BoHV-1病毒感染。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》(2008版) 关于检测牛冷冻精液 中BoHV-1病毒的实时荧光PCR方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BoHV-1:bovineherpesvirustype1,牛疱疹病毒I型。 Ct值:荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。 DNA:deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸。 DTT:DL-dithiothreitol,二硫苏糖醇。 EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸。 IBR:bovineinfectiousrhinotracheitis,牛传染性鼻气管炎。 PBS:phosphatebuffersolution,磷酸盐缓冲生理盐水。 PCR:polymerasechainreaction,聚合酶链式反应。 SDS:sodiumdodecylsulfate,十二烷基磺酸钠。 UDG酶:uracilDNAglycosylase,尿嘧啶DNA糖基化酶。 4 设备和器材 4.1 荧光PCR仪。 4.2 台式冷冻离心机。 4.3 可调微量移液器:规格10μL、100μL、200μL、1mL。 4.4 带滤芯微量吸头:规格10μL、100μL、200μL、1mL。 4.5 PCR光学反应管。 4.6 微量离心管。 4.7 涡旋混匀器。 4.8 恒温培养箱。 4.9 冰箱:规格2℃~8℃,-20℃,-80℃。 1GB/T27981—2011 4.10 恒温水浴箱。 5 试剂 除另有规定,本方法试验用水应按照GB/T6682中规定的二级水,所用化学试剂均为分析纯。 5.1 引物与探针 引物与探针配制采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100μmol/L储存液,置 -20℃或更低温度冻存;使用时取适量配制成10μmol/L工作液,避免多次冻融。 引物与探针序列: gB基因上游引物gB-F:5’TGTGGACCTAAACCTCACGGT3’ gB基因下游引物gB-R:5’GTAGTCGAGCAGACCCGTGTC3’ gB基因探针:5’[FAM]-AGGACCGCGAGTTCTTGCCGC[BHQ-1]3’ 探针5’端标记的报告荧光基团及3’端标记的淬灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行 选定。 5.2 蛋白酶K溶液:配制方法见附录A。 5.3 柠檬酸钠缓冲液:配制方法见附录A。 5.4 0.5mol/LEDTA:配制方法见附录A。 5.5 0.01mol/LpH7.2PBS:配制方法见附录A。 5.6 10%chelex100:配制方法见附录A。 5.7 1mol/LDTT:配制方法见附录A。 5.8 2×定量PCR-UDG酶预混液:含60U/mL热启动Taq酶,40mmol/LTris-HCl(pH8.4), 100mmol/LKCl,6mmol/LMgCl2,400μmol/LdGTP,400μmol/LdATP,400μmol/LdCTP, 800μmol/LdUTP,40U/mLUDG。可采用经验证可靠的商品化预混液。 5.9 核酸抽提试剂盒。 5.10 无DNA酶、无RNA酶水。 5.11 无水乙醇。 5.12 70%乙醇:用新开启的无水乙醇和无DNA酶、无RNA酶水配制,-20℃预冷。 5.13 三氯甲烷。 5.14 异丙醇。 6 样品采集与处理 6.1 样品采集及前处理 6.1.1 采样工具 采样工具需经(121±2)℃/0.1MPa高压15min并烘干,或经160℃干烤2h灭菌。 6.1.2 血清、全血 用无菌注射器或采血专用真空管针无菌自牛静脉采血,无菌分离血清,直接用于核酸提取。 用无菌注射器或采血专用真空管针无菌自牛静脉采血,将血液直接滴入抗凝剂中,并立即连续摇 动,充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液,或0.5mol/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂。直 接用于核酸提取。 6.1.3 拭子 用无菌棉拭子采集鼻道、生殖器官和眼分泌物,采集时,将拭子反复刮擦呼吸道或生殖器官粘膜,蘸 2GB/T27981—2011 取分泌物后,立即将棉拭子浸入1mL~2mL灭菌0.01mol/LpH7.2的PBS中,4℃储存,尽快送达 实验室。取样进行检验时,充分振动、挤干拭子,浸泡液采用4000r/min离心1min,取上清备用。 6.1.4 精液 将冷冻精液样品或新鲜精液样品分装到1.5mL微量离心管中,充分解冻后,振荡混匀,采用 12000r/min离心30s,取上清按6.2.1或6.2.3进行核酸提取;或取原液按6.2.2或6.2.3提取核 酸。每一批次冷冻精液取3支冻精管,分别进行核酸提取和后续检测。 6.1.5 组织样品 剖检时无菌采集动物呼吸道粘膜、扁桃腺、肺部和支气管淋巴结,对流产胎儿,采集刚死亡胎儿肝、 肺、肾、脾和胎盘组织。检测时,用无菌剪、镊取适量样品,按1∶5的比例加入灭菌0.01mol/LpH7.2 的PBS(例:1g组织样品加5mL溶液),在研钵中剪碎,充分研磨,取研磨物分装到离心管中,冻融2次~ 3次,4000r/min离心5min,取上清备用。 6.1.6 细胞培养物 细胞培养物冻融2次~3次,分装到1.5mL微量离心管中,4000r/min离心1min,取上清备用。 6.2 样品核酸抽提 6.2.1 有机溶剂抽提法 适用于上述各种样品。取200μL经前处理的样品或对照,加200μL0.01mol/LpH7.2PBS缓冲 液,加SDS、蛋白酶K至终浓度分别为1%和0.5mg/mL,混匀器上振荡混匀,56℃温育30min,置沸 水浴孵育8min;加等体积三氯甲烷,振荡混匀,12000r/min,离心10min,取上清;可重复三氯甲烷处 理步骤一次;加等体积异丙醇(-20℃预冷),振荡混匀;4℃,13000r/min离心10min,弃上清;加等 体积70%乙醇,振荡混匀,4℃,13000r/min离心10min;小心吸弃上清,吸头不要碰到有沉淀一面,倒 置于吸水纸上,尽量沾干液体(不同样品需在吸水纸不同地方沾干),在洁净工作台室温干燥5min;加 入50μL无DNA酶、无RNA酶水,轻轻混匀,溶解管壁上的核酸,室温放置10min,直接用于检测,或 贮-20℃备用。长期贮存,应置-80℃或更低温度。 6.2.2 Chelex100提取法 采纳世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》(2008版)操作程序,适用于精 液样品。 在微量离心管中,加入10%chelex100溶液100μL,蛋白酶K(10mg/mL)11.5μL,1mol/LDTT 7.5μL,90μL无DNA酶、无RNA酶水,10μL精液样品,充分混匀;置56℃温育30min,充分振荡混 匀10s;置沸水浴孵育8min,充分振荡混匀10s;用12000r/min离心3min,取上清直接用于检测,或 贮-20℃备用。长期贮存,应置-80℃或更低温度。 6.2.3 试剂盒抽提法 可采用经验证等效的商品化核酸抽提试剂盒方法。 7 实时荧光PCR检测 7.1 对照设立 7.1.1 样品设置要求:从样品处理开始,应设置阳性对照、阴性对照。 7.1.2 阳性对照:取已知阳性的同类样品作为阳性对照。也可将适量BoHV-1病毒或含阳性模板的 3GB/T27981—2011 质粒DNA添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。 7.1.3 阴性对照:取已知阴性的同类样品作为阴性对照。 7.1.4 空白对照:在扩增反应阶段设置。以无DNA酶、无RNA酶水作为模板设置空白对照。 7.2 实时荧光PCR检测 7.2.1 加样 反应体系采用25μL反应体积,其中,含2×定量PCR-UDG预混液12.5μL,上、下游引物各 200nmol/L,探针100nmol/L,模板5μL(100pg~1μg),补加适量无DNA酶、无RNA酶水使反应总 体