ICS65.020.30 B43 中华人民共和国国家标准 GB/T27642—2011 牛 个体及亲子鉴定微卫星DNA法 BovineindividualandparentalidentificationusingmicrosatelliteDNA 2011-12-30发布 2012-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布目 次 前言 Ⅲ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 术语、定义和缩略语 1 ……………………………………………………………………………………… 4 原理 2 ……………………………………………………………………………………………………… 5 防污染措施 2 ……………………………………………………………………………………………… 6 个体鉴定和亲子鉴定试验步骤 2 ………………………………………………………………………… 附录A(资料性附录) 试剂配制及仪器 4 ………………………………………………………………… 附录B(资料性附录) DNA样品的制备 6 ………………………………………………………………… 附录C(资料性附录) 光谱校正和PCR反应、测定及分析 8 …………………………………………… 附录D(资料性附录) FAO-ISAG推荐的牛微卫星DNA标记 10 ……………………………………… 附录E(资料性附录) 个体及亲子鉴定计算方法 12 ……………………………………………………… ⅠGB/T27642—2011 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009的规则进行起草。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。 本标准起草单位:全国畜牧总站。 本标准主要起草人:刘丑生、王志刚、孙飞舟、邱小田、韩旭、于福清、张桂香。 ⅢGB/T27642—2011 牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法 1 范围 本标准规定了利用微卫星DNA标记进行牛个体及亲子鉴定的技术规程。 本标准适用于普通牛(Bostaurus)个体和亲子鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GA/T383 法庭科学DNA实验室检验规范 SN/T1193 基因检验实验室技术要求 3 术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本文件。 3.1 聚合酶链式反应 polymerasechainreaction,PCR 以一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)为原料,在合适的温度、离子条件和耐热 DNA聚合酶催化下,在体外人工合成特异的DNA片段的过程。 3.2 微卫星DNA microsatelliteDNA 亦称短串联重复序列或简单重复序列(shorttandemrepeats,STRs;simplesequencerepeats, SSRs),以1bp~6bp的短核苷酸序列为基本单位,呈串联重复状散在分布于生物体基因组中。 3.3 非父排除概率 probabilityofpaternityexclusion,PE 通过检测某一个遗传标记,能将不是生父的争议父亲排除的概率。 3.4 累积非父排除概率 cumulativeprobabilityofpaternityexclusion,CPE 通过检测某一遗传标记系统的多个遗传标记,将不是生父的个体否定掉的累计概率。 3.5 亲权指数 paternityindex,PI 争议父亲提供生父等位基因成为子代生父的概率与随机公畜提供生父基因成为子代生父概率的 比值。 3.6 累积亲权指数 cumulativepaternityindex,CPI 根据某一遗传标记系统中的多个标记,计算多个亲权指数的累积。 3.7 父子关系相对概率 relativechanceofpaternity,RCP 争议父亲是亲生父亲的相对概率。 1GB/T27642—2011 4 原理 4.1 个体鉴定原理 某一被检样品与真样品微卫星标记的基因型不同,则判定被检样品与真样品来自不同个体,如果相 同不排除它们来自同一个体,通过对某一遗传标记系统的多个标记所检测,可在一定概率水平上判定被 测样品与真样品是否来自同一个体。 4.2 亲子鉴定原理 根据孟德尔遗传分离定律,在配子细胞形成时,成对的等位基因彼此分离,随机进入配子细胞。双 亲的配子细胞结合形成合子,其发育出来的子代的成对等位基因分别来自父亲和母亲。根据多个标记 计算的鉴定结果在一定概率水平上可以判定争议父亲(母亲)是否为亲生父亲(母亲)(变异情况除外)。 5 防污染措施 按SN/T1193和GA/T383规定的方法执行。 6 个体鉴定和亲子鉴定试验步骤 6.1 样品制备 收集血液、组织(耳、肌肉、尾、皮肤等)、毛囊或精液等材料。 6.2 样品DNA的制备 各样品试剂配方、所需的仪器设备参见附录A,具体步骤参见附录B。 6.3 光谱校正 在实验前进行一次四色荧光素的光谱校正,目的为了校准信号重叠。具体步骤参见C.1。 6.4 微卫星DNA标记 参见附录D。 6.5 PCR反应 6.5.1 PCR反应体系 参见表C.1。 6.5.2 PCR反应程序 参见表C.2。 6.5.3 PCR产物电泳检测 取适量PCR产物,上样于1%~3%的琼脂糖凝胶中进行电泳,检测本次扩增反应是否成功。 2GB/T27642—2011 6.6 测定及分析 通过分析得到微卫星标记的基因型频率。参见C.3。 6.7 利用微卫星DNA法进行个体鉴定的概率计算和结果表述 被检样品的基因型与真样品不同,可排除两份样品来源于同一个体(变异情况除外)。如果两份样 品的基因型相同时,则按式(1)计算偶合概率,当其值小于该个体所在群体数量的倒数时(5×10-9),认 定两份样品来源于同一个体。偶合概率是一组微卫星标记基因型频率的乘积。 PM=P1×P2×P3×……×Pn…………………………(1) 式中: PM———偶合概率; P———第i个微卫星标记的基因型频率。 6.8 利用微卫星DNA法进行亲子鉴定认定和排除依据 累积非父排除率≥99.73%、父子关系相对概率≥99.95%或累积亲权指数≥2000,判定争议父亲 为生父;累积非父排除率低于99.73%并且有3个以上标记不符合孟德尔遗传分离规律时,排除亲缘关 系;如果累积非父排除率低于99.73%并且有3个以下的作为不符合孟德尔遗传分离规律时,应适当增 加检测的标记数量。具体计算公式参见附录E。 3GB/T27642—2011 附 录 A (资料性附录) 试剂配制及仪器 A.1 试剂配制 A.1.1 血液裂解液见表A.1。 表A.1 血液裂解液 贮存液浓度体积 mL使用浓度 1mol/LTris-HCl(pH8.0) 1 10mmol/L 0.5mol/LEDTA(pH8.0) 20 100mmol/L 10%SDS 20 2% 灭菌双蒸水加至 100 — A.1.2 组织DNA及毛囊提取液见表A.2。 表A.2 组织DNA提取液 贮存液浓度体积 mL使用浓度 1mol/LTris-HCl(pH8.0) 5 50mmol/L 0.5mol/LEDTA(pH8.0) 20 100mmol/L 0.5mol/LNaCl 20 100mmol/L 10%SDS 20 2% 灭菌双蒸水加至 100 — A.1.3 精子裂解液见表A.3。 表A.3 精子裂解液 贮存液浓度体积 mL使用浓度 1mol/LTris-HCl(pH8.0) 1 10mmol/L 0.5mol/LEDTA(pH8.0) 2 10mmol/L 0.5mol/LNaCl 20 100mmol/L 10%SDS 20 2% 1mol/LDTT(现用现加) 0.0039 39μmol/L 灭菌双蒸水加至 100 — 4GB/T27642—2011 A.1.4 精子洗涤液 取1mol/L的NaCl37.5mL,0.5mol/L的EDTA5mL,加双蒸水至250mL。高压灭菌备用。 A.1.5 蛋白酶K贮存液(20mg/mL) 200mg蛋白酶K溶于10mL灭菌双蒸水中,分装,每管1mL,-20℃冻存。 A.1.6 TE缓冲液(pH8.0) 10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。 A.1.7 电泳缓冲液 1×Tris-乙酸(TAE):0.04mol/LTris-乙酸,0.01mol/L EDTA。 0.5×Tris-硼酸(TBE):0.045mol/LTris-硼酸,0.01mol/L EDTA。 A.1.8 溴化乙锭溶液(EB,10mg/mL) 用少量双蒸水溶解1g溴化乙锭,磁力搅拌数小时以确保其完全溶解,定容至100mL,然后转移到 棕色瓶或铝箔包裹容器中,室温保存。 A.1.9 6×上样缓冲液 0.05%溴酚蓝,0.12%二甲苯青FF,40%(质量浓度)蔗糖水溶液; 或0.05%溴酚蓝,0.12%二甲苯青FF,30%(体积分数)甘油水溶液。 A.1.10 1mol/L二硫苏糖醇(DTT) 用20mL0.01mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)溶解3.09gDTT,过滤除菌后分装成1mL贮存于 -20℃。注意:DTT或含