ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27640—2011 马 痘诊断技术 Diagnostictechniquesforhorsepoxdisease 2011-12-30发布 2012-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国动物卫生与流行病学中心。 本标准主要起草人:梁成珠、朱来华、肖西志、郑小龙、邓明俊、岳志芹、毕道荣、梁君妮、徐彪。 ⅠGB/T27640—2011 马痘诊断技术 1 范围 本标准规定了马痘临床诊断、病毒分离与鉴定等诊断技术要求。 本标准适用于马痘的诊断。 2 临床检查 2.1 临床特征 病马于系部和球节处的皮肤上出现丘疹,随后变为水疱,最后为脓疱,并干涸而结痂。由于局部疼 痛,可引起跛行,病马一般不显全身症状;有的病马于唇内侧、齿龈、舌、舌系带、颊部等粘膜上发生痘疹, 也是先发丘疹,继而水疱和脓疱,脓疱破裂形成浅的溃疡;母畜外生殖器水肿,并在皮肤和粘膜上形成水 疱、脓疱和溃疡,公畜的病变表现为阴茎、包皮和龟头上的痘疹样病变。 2.2 初步判定 2.2.1 根据临床特征可作出病马感染马痘的初步判定。 2.2.2 最终判定应进行病毒分离鉴定。 3 病毒分离 3.1 样品采集和运送要求 采取病变部位的渗出液、水疱液和溃疡部位组织作为采集对象,尽量无菌采集,采集后低温送实验 室进行病毒分离。 3.2 病毒分离试验 3.2.1 所需仪器、设备 3.2.1.1 CO2培养箱。 3.2.1.2 Ⅱ级生物安全柜。 3.2.1.3 倒置显微镜。 3.2.1.4 带冷冻功能的离心机。 3.2.2 材料准备 3.2.2.1 细胞培养基DMEM。 3.2.2.2 Hela细胞。 3.2.2.3 Hanks液(Hanks液,见A.1;含抗生素,见A.4)。 3.2.2.4 小牛血清。 3.2.2.5 待检马组织:采取病变部渗出液、水疱液或丘疹和溃疡部组织作为标本,用Hanks液配制成 1∶10悬液,以1500r/min离心10min,取上清备用。 1GB/T27640—2011 3.2.2.6 接种方法:用含10%小牛血清的DMEM培养液培养Hela细胞,待细胞长成单层后弃去培养 液。将3.2.2.5中的待检组织接种Hela细胞,然后加入含5%小牛血清的DMEM培养液。CO2培养 箱内37℃,48h后观察细胞病变。 3.3 判定 如果48h后出现明显的细胞病变,如细胞圆缩、聚集,可进一步做病毒鉴定。正常的Hela细胞为 多角形,贴壁生长。 4 电子显微镜检查 4.1 材料准备 4.1.1 戊二醛,碳网膜,三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA),磷钨酸(pH7.2),滤纸,载 玻片。 4.1.2 病毒液或待检病料,如病变部位的渗出液或水疱液。 4.2 负染操作方法 4.2.1 用戊二醛固定待检病料。 4.2.2 负染方法为:取一滴待检病料于载玻片上,将碳网膜漂浮于液滴上1min,再置于一滴三羟甲基 氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)缓冲液中浸泡20s,然后用一滴1%的磷钨酸(pH7.2)染色10s。 取出碳网膜,用滤纸吸干膜上液体,待自然干燥后镜检。 4.3 判定 电镜下见到砖形或大卵圆形,有一个双凹面的核心体,同时具有包膜。观察到上述结果,可判定为 马痘感染。 5 分子生物学检测 5.1 材料准备 5.1.1 待检样品材料 分离的病毒、病毒感染的细胞或所采集的病料,如病变部位的渗出液或水疱液。 5.1.2 仪器设备 PCR仪,恒温水浴锅,电泳仪,冷冻离心机,凝胶成像系统或其他类似设备(观察电泳结果),微波炉 或相关仪器(琼脂糖凝胶的制备),超声波破碎仪,-20℃冰箱。 5.1.3 试剂 0.25%胰蛋白酶溶液(见A.2),RNase,70%乙醇,TaqDNA聚合酶,PBS缓冲液,酚三氯甲烷,引 物,dNTPs,去离子水,加样缓冲液,电泳缓冲液,溴化乙锭溶液(见B.3)或相关染料(现在已经有溴化乙 锭的替代产品,而且无致癌性,如GelRed)。缓冲液的配方见附录B。 5.2 病毒基因组DNA的制备 用0.25%的胰酶消化感染病毒的Hela细胞,3000r/min离心5min,收集的细胞沉淀用PBS缓冲 2GB/T27640—2011 液重悬,于95℃水浴灭活30min。重复离心,收集沉淀。再用2mLPBS缓冲液重悬细胞。将细胞至 于冰浴,超声波粉碎,输出功率为40W,时间3min,每5s暂停5s。细胞经破碎后加入10μLRNase, 37℃反应30min。待溶液温度降至室温后,加入400μL酚三氯甲烷,混匀后于冰浴中放置5min,然后 13000r/min离心5min,收集DNA沉淀。用70%乙醇洗沉淀一次。空气干燥沉淀,加入100μL去离 子水溶解DNA,分装保存于-20℃冰箱中备用。本步骤也可采取相关商品化的病毒DNA提取试剂 盒。采集的病料可采取同样的方法或用商品化试剂盒进行病毒DNA的提取。 5.3 痘苗病毒血细胞凝集素HA(Hemagglutinin,HA)基因的PCR扩增 5.3.1 引物序列 上游引物:5’-ATGACACGATTGCCAATAC-3’; 下游引物:5’-CTAGACTTTGTTTTCTG-3’。 5.3.2 各反应物浓度 引物25pmol/μL,dNTPs2.5mmol/μL,TaqDNA聚合酶5U/μL,反应体系为25μL。 5.3.3 扩增条件 93℃,5min,92℃,30s;55℃,30s;72℃,1min。共35个循环。预扩增片段大小为940bp。 5.3.4 电泳 制备1%琼脂糖凝胶板,加样6μL~8μL,电压80V~100V,电流40mA~50mA,电泳30min~ 40min。 5.4 马痘病毒的PCR检测 5.4.1 引物序列 上游引物:5’-GAAAATCCAGATACAGCCACC-3’; 下游引物:5’-ACGCTGAAACGGAACCTGTAT-3’。 5.4.2 各反应物浓度 引物25pmol/μL,dNTPs2.5mmol/μL,TaqDNA聚合酶5U/μL,反应体系为25μL。 5.4.3 扩增条件 93℃,5min,93℃,30s,53℃,30s,72℃,30s,35个循环。预片段大小为637bp。 5.4.4 电泳 制备1%琼脂糖凝胶板,加样6μL~8μL,电压80V~100V,电流40mA~50mA,电泳30min~ 40min。 5.4.5 结果判定 如果不出现940bp和637bp大小的片段,判定为阴性;如果出现940bp和637bp中的任何一个片 段则判定为阳性,并对PCR产物进行测序,与参考毒株进行序列比对。 3GB/T27640—2011 6 结果的综合判定 根据2.2,可作出初步判定。确诊需要根据4.3、5.4.5进行最终判定,如果电子显微镜检查发现特 征性病毒粒子可判为马痘阳性,否则为阴性;如果PCR检测结果为阳性,可判为马痘阳性,否则为马痘 阴性。当4.3和5.4.5结果不一致时,以5.4.5结果为准。 4GB/T27640—2011 附 录 A (规范性附录) 细胞培养用试剂的配制 A.1 汉克液(Hanks)(10倍浓缩液) A.1.1 成分 A.1.1.1 成分甲 氯化钠 80.0g 氯化钾 4.0g 氯化钙 1.4g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 2.0g A.1.1.2 成分乙 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 1.52g 磷酸二氢钾 0.6g 葡萄糖 10.0g 1%酚红 16mL A.1.2 配制方法 按顺序将上述成分分别溶于双蒸水450mL中,即配成甲液和乙液,然后将乙液缓缓加入甲液,边 加边搅拌。补足双蒸水至1000mL。用滤纸过滤后,加入三氯甲烷2mL,置2℃~8℃保存。 A.1.3 使用方法 使用时,用双蒸水稀释10倍,107.6kPa灭菌15min,置4℃保存备用。用前以7.5%碳酸氢钠溶 液调pH为7.2~7.4。 A.2 0.25%胰蛋白酶溶液 A.2.1 成分 氯化钠 8.0g 氯化钾 0.2g 柠檬酸钠(Na3C6H5O7·5H2O) 1.12g 磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O) 0.056g 碳酸氢钠 1.0g 胰蛋白酶(1∶250) 2.5g 双蒸水 加至1000mL A.2.2 配制方法 放2℃~8℃冰箱过夜,待胰酶充分溶解后,用碳酸氢钠溶液调pH为7.4~7.6。用0.2μm的微 5GB/T27640—2011 孔膜或G6型玻璃滤器滤过除菌。分装于小瓶中,-20℃保存。 A.3 EDTA-胰蛋白酶分散液(10倍浓缩液) A.3.1 成分 氯化钠 80.0g 氯化钾 4.0g 葡萄糖 10.0g 碳酸氢钠 5.8g 胰蛋白酶(1∶250) 5.0g 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na) 2.0g 按顺序溶于双蒸水900mL中,然后加入下列各液: 1%酚红溶液 2.0mL 青霉素(10万IU/mL) 10.0mL 链霉素(10万μg/mL) 10.0mL 补足双蒸水至 1000mL A.3.2 过滤除菌 用0.2μm的微孔膜或G6型玻璃滤器滤过除菌。分装小瓶,-20℃保存。 A.3.3 分装 临用前,用双蒸水稀释10倍,适量分装于试管中,-20℃冻存备用。 A.3.4 使用方法 分