ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27639—2011 结 核病病原菌实时荧光PCR检测方法 Real-timePCRmethodforthedetectionoftuberculosispathogenicorganisms 2011-12-30发布 2012-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局、华中农业大学、中国检验检疫科学研究 院、北京盈九思科技发展有限公司。 本标准主要起草人:陈茹、刘中勇、杨国海、郭爱珍、曾碧健、韩雪清、高小博、林祥梅、吴晓薇。 ⅠGB/T27639—2011 结核病病原菌实时荧光PCR检测方法 1 范围 本标准规定了结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌实时荧光PCR检测方法的技术要 求和操作规范。 本标准适用于快速检测细菌培养物、血样、奶样、痰液、组织器官、粪便等临床样品中结核分枝杆菌 复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489—2008 实验室 生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值:荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。 dNTP:deoxyribonucleosidetriphosphate,脱氧核苷三磷酸。 DMSO:dimethylsulfoxide,二甲基亚砜。 EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸。 PBS:phosphatebuffersolution,磷酸盐缓冲液。 PCR:polymerasechainreaction,聚合酶链式反应。 Taq酶:TaqDNA聚合酶。 UDG酶:uracilDNAglycosylase,尿嘧啶DNA糖基化酶。 4 原理 本标准方法采用了TaqMan探针实时荧光PCR技术原理。反应体系中包括一对用于扩增DNA 的引物,和一条能与PCR产物特异杂交的荧光标记探针。探针的5’端标记了被称为报告基团的荧光 素,3’端标记了淬灭基团。在进行PCR延伸反应时,Taq酶的5’外切酶活性将5’端荧光基团从探针上 切割下来,使其与淬灭基团分离,从而仪器能检测到5’端荧光基团所发出的荧光信号,一分子PCR扩 增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生。随着扩增循环次数的增加,仪器检测到的荧光信号的累积 反应了扩增产物量的变化。 本标准提供特异检测结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌共四套实时荧光PCR检测 方法(见表1)。其中,结核分枝杆菌复合群特异的实时荧光PCR方法分别以IS6110、IS1081插入基因 序列为模板设计特异扩增引物与探针;结核分枝杆菌、牛分枝杆菌特异的实时荧光PCR方法分别以菌 种特异的基因组序列为模板设计特异扩增引物与探针。 1GB/T27639—2011 表1 荧光PCR引物与探针序列 类别 核酸序列 结核分枝杆菌复合 群(IS6110) 上游引物:5’GCAGGGTTCGCCTACGTG3’ 下游引物:5’CGGGTCCAGATGGCTTGC3’ 探针a:5’-FAM-TGTCACCGACGCCTACGCTCGC3’-BHQ-1 结核分枝杆菌复合 群(IS1081) 上游引物:5’CCAGGAACGCCTCAACC3’ 下游引物:5’CGACGAGGCGGATGATC3’ 探针a:5’-FAM-AGAGGTACGACGCCGAACCGAC-BHQ-1 结核分枝杆菌 上游引物:5’CGGTGTAATCAGTTTTGAAGC3’ 下游引物:5’CGATTGGAACGGCGAAGC3’ 探针a:5’-FAM-TAGGTAGTCCAGTAGAGCCCCATAGCCA3’-BHQ-1 牛分枝杆菌 上游引物:5’ACGCCTTCCTAACCAGAATTG3’ 下游引物:5’GGCTATTGACCAGCTAAGATATCC3’ 探针a:5’-FAM-AATTCATACAAGCCGTAGTCGTGCAGAA3’-BHQ-1 a探针5’端标记的报告荧光基团及3’端标记的淬灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行选定。 5 材料与试剂 5.1 仪器与耗材 5.1.1 接种棒。 5.1.2 无菌注射器或真空采血管。 5.1.3 灭菌容器。 5.1.4 橡胶管。 5.1.5 刮匙。 5.1.6 Ⅱ级生物安全柜。 5.1.7 荧光PCR仪。 5.1.8 恒温水浴锅(室温至100℃)。 5.1.9 离心机(最高离心力达15000×g以上)。 5.1.10 混匀器。 5.1.11 冰箱(2℃~8℃,-20℃,-80℃)。 5.1.12 天平(精密度达千分之一以上)。 5.1.13 微量可调移液器(10μL,100μL,1000μL)。 5.1.14 微量带滤芯吸嘴(10μL,100μL,1000μL)。 5.1.15 研钵。 5.1.16 离心管。 5.1.17 PCR光学反应管。 5.2 试剂 5.2.1 试剂级别:除另有规定,本方法试验用水应符合GB/T6682—2008规定的二级水,所用化学试 2GB/T27639—2011 剂均为分析纯。 5.2.2 引物与探针:采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针(序列见表1)配制成100μmol/L 储存液,置-20℃或更低温度冻存;使用时取适量配制成10μmol/L工作液,避免多次冻融。 5.2.3 0.01mol/LpH7.6PBS:配方见A.1。 5.2.4 柠檬酸钠缓冲液:配方见A.2。 5.2.5 0.5mol/LEDTA:配方见A.3。 5.2.6 柠檬酸钠-磷酸缓冲液:配方见A.4。 5.2.7 4%氢氧化钠溶液:配方见A.5。 5.2.8 4%硫酸溶液:配方见A.6。 5.2.9 TritonX-100。 5.2.10 DNA提取液:含100mmol/LTris-HCl(pH8.0),0.01%TritonX-100,200μg/μL蛋白酶K。 也可采用等效商品化试剂。 5.2.11 灭菌双蒸水。 5.2.12 三氯甲烷。 5.2.13 异丙醇。 5.2.14 无水乙醇。 5.2.15 70%乙醇:用新开启的灭菌双蒸水配制,-20℃预冷。 5.2.16 荧光PCR反应缓冲液:含50mmol/LKCl,10mmol/LTris-HCl(pH8.3),2.5mmol/L MgCl2,5%二甲基亚砜(DMSO),5%甘油。可采用等效商品化试剂。 5.2.17 dNTP:dATP、dUTP、dCTP和dGTP。 5.2.18 Taq酶。 5.2.19 UDG酶。 6 生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作,应遵守GB19489—2008的有关规定。 7 采样 7.1 样品采集 7.1.1 细菌培养物 直接取液体培养基培养的菌液;对于在固体培养基上生长的菌落,用接种棒挑取适量(取用量达到 肉眼可见,菌团大小不超过接种环)菌样,放到0.01mol/LpH7.6PBS中,振荡混匀形成悬浮菌液。 7.1.2 血样 用无菌注射器或真空采血管,无菌自动物静脉采血,无菌分离血清。 用无菌注射器或真空采血管,无菌自动物静脉采血,将血液直接滴入抗凝剂中,并立即连续摇动,充 分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液,或0.5mol/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂。 条件允许时,建议优先采集全血,以更有利于富集菌体。 7.1.3 奶样 无菌采集奶液于灭菌的容器中。一般以后段奶液含菌量较多,早晨挤出的奶液含菌量最高。 3GB/T27639—2011 7.1.4 痰液 动物痰液采集:动物咯痰极少,宜在清晨采集,用橡胶管自口腔伸入至气管内,外接注射器吸取痰 液。亦可取咳出的痰块。人痰液采集:采集清晨从肺深处咳出的痰液。用灭菌容器密闭送检。 7.1.5 组织器官 采集动物下颌、咽后、支气管、肺(特别是肺门及肺门淋巴结)、纵隔和肠系膜淋巴结,以及病变组织 器官如肝、脾、肺等。 7.1.6 粪便 采集混有粘液、血液、粘膜的粪便,或用刮匙从动物直肠深部(约30cm)取少量粘液粪便,盛于灭菌 容器中。 7.2 样品的保存和运输 待检样品在2℃~8℃保存不应超过24h;-20℃保存不超过三个月;-80℃以下长期保存。样 品应置于低温、密封的容器内运输。 8 荧光PCR操作方法 8.1 样品前处理 8.1.1 血样、细菌培养物(菌液)前处理 取1mL~2mL全血样品,15000×g离心10min,弃上清;加等体积灭菌双蒸水充分振荡,15000×g 离心10min;弃上清,若红血球裂解不完全,需采用灭菌双蒸水重复洗涤;收集沉淀物,继续进行核酸提 取,或置-20℃贮存备用。 取1mL~2mL血清、菌液样品,15000×g离心10min,弃上清,加1mL0.01mol/LpH7.6PBS, 充分振荡混匀,15000×g离心10min;弃上清,收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置-20℃贮存备用。 8.1.2 奶样前处理 取10mL奶液,加100μLTritonX-100,振荡混匀,2500×g离心20min;弃上清,取沉淀,加1mL 0.01mol/LpH7.6