ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27637—2011 副 结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法 Real-timePCRmethodforthedetectionof Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis 2011-12-30发布 2012-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局、吉林农业大学、北京盈九思科技发展有 限公司。 本标准主要起草人:刘中勇、陈茹、杨国海、高云航、曾碧健、朱道中、吴晓薇、高小博。 ⅠGB/T27637—2011 副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法 1 范围 本标准规定了副结核分枝杆菌(Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis)实时荧光PCR检 测方法的技术要求和操作规范。 本标准适用于快速检测培养物、血样、奶样、粪便和组织等临床样品中副结核分枝杆菌。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489—2008 实验室 生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值:荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。 dNTP:deoxyribonucleosidetriphosphate,脱氧核苷三磷酸。 DMSO:dimethylsulfoxide,二甲基亚砜。 EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸。 PBS:phosphatebuffersolution,磷酸盐缓冲液。 PCR:polymerasechainreaction,聚合酶链式反应。 Taq酶:TaqDNA聚合酶。 UDG酶:uracilDNAglycosylase,尿嘧啶DNA糖基化酶。 4 原理 本标准方法采用了TaqMan探针实时荧光PCR技术原理。反应体系中包括一对用于扩增DNA 的引物,和一条能与PCR产物特异杂交的荧光标记探针。探针的5’端标记了被称为报告基团的荧光 素,3’端标记了淬灭基团。在进行PCR延伸反应时,Taq酶的5’外切酶活性将5’端荧光基团从探针上 切割下来,使其与淬灭基团分离,从而仪器能检测到5’端荧光基团所发出的荧光信号,一分子PCR扩 增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生。随着扩增循环次数的增加,仪器检测到的荧光信号的累积 反应了扩增产物量的变化。本标准方法以副结核分枝杆菌特异的F57基因序列为模板,设计特异扩增 引物和探针建立荧光PCR反应体系。 5 材料与试剂 5.1 仪器与耗材 5.1.1 接种棒。 1GB/T27637—2011 5.1.2 无菌注射器或真空采血管。 5.1.3 灭菌容器。 5.1.4 橡胶管。 5.1.5 刮匙。 5.1.6 荧光PCR仪。 5.1.7 恒温水浴锅(室温至100℃)。 5.1.8 离心机(最高离心力达15000×g以上)。 5.1.9 混匀器。 5.1.10 冰箱(2℃~8℃,-20℃,-80℃)。 5.1.11 天平(精密度达千分之一以上)。 5.1.12 微量可调移液器(10μL,100μL,1000μL)。 5.1.13 微量带滤芯吸嘴(10μL,100μL,1000μL)。 5.1.14 研钵。 5.1.15 离心管。 5.1.16 PCR光学反应管。 5.2 试剂 5.2.1 试剂级别:除另有规定,本方法试验用水应符合GB/T6682—2008规定的二级水,所用化学试 剂均为分析纯。 5.2.2 引物与探针:采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100μmol/L储存液,置 -20℃或更低温度冻存;使用时取适量配制成10μmol/L工作液,避免多次冻融。上游引物: 5’GTCAGCGGCGGTCCAG3’,下游引物:5’GCAGCTCCAGATCGTCATTC3’,探针:5’-FAM- ACGAGCACGCAGGCATTCCAAGTC3’-BHQ-1。 5.2.3 0.01mol/LpH7.6PBS:配方见A.1。 5.2.4 柠檬酸钠缓冲液:配方见A.2。 5.2.5 0.5mol/LEDTA:配方见A.3。 5.2.6 柠檬酸钠-磷酸缓冲液:配方见A.4。 5.2.7 4%氢氧化钠溶液:配方见A.5。 5.2.8 4%硫酸溶液:配方见A.6。 5.2.9 TritonX-100。 5.2.10 DNA提取液:含100mmol/LTris-HCl(pH8.0),0.01%TritonX-100,200μg/μL蛋白酶K。 也可采用等效商品化试剂。 5.2.11 灭菌双蒸水。 5.2.12 三氯甲烷。 5.2.13 异丙醇。 5.2.14 无水乙醇。 5.2.15 70%乙醇:用新开启的灭菌双蒸水配制,-20℃预冷。 5.2.16 荧光PCR反应缓冲液:含50mmol/LKCl,10mmol/LTris-HCl(pH8.3),2.5mmol/L MgCl2,5%二甲基亚砜(DMSO),5%甘油。可采用等效商品化试剂。 5.2.17 dNTP:dATP、dUTP、dCTP和dGTP。 5.2.18 Taq酶。 5.2.19 UDG酶。 2GB/T27637—2011 6 生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作,应遵守GB19489—2008的有关规定。 7 采样 7.1 样品采集 7.1.1 培养物 直接取液体培养基培养的菌液;对于在固体培养基上生长的菌落,用接种棒挑取适量(取用量达到 肉眼可见,菌团大小不超过接种环)菌样,放到0.01mol/LpH7.6PBS中,振荡混匀形成悬浮菌液。 7.1.2 血样 用无菌注射器或真空采血管,无菌自动物静脉采血,无菌分离血清。 用无菌注射器或真空采血管,无菌自动物静脉采血,将血液直接滴入抗凝剂中,并立即连续摇动,充 分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液,或0.5mol/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂。 条件允许时,建议优先采集全血,以更有利于富集菌体。 7.1.3 奶样 无菌采集奶液于灭菌的容器中。一般以后段奶液含菌量较多,早晨挤出的奶液含菌量较高。 7.1.4 粪便 取新鲜粪便,选取腹泻粪便或混有粘液、血液、粘膜的粪便,或用刮匙从动物直肠深部(约30cm)取 少量粘液粪便,盛于灭菌容器中。 7.1.5 组织 选取有明显病变的肠段、回盲瓣以及病肠相邻部位的淋巴结。 7.2 样品的保存和运输 待检样品在2℃~8℃保存不应超过24h;-20℃保存不超过三个月;-80℃以下长期保存。样品 应置于低温、密封的容器内运输。 8 操作方法 8.1 样品前处理 8.1.1 血样、培养物(菌液)前处理 取1mL~2mL全血样品,15000×g离心10min,弃上清;加等体积灭菌双蒸水充分振荡, 15000×g离心10min;弃上清,若红血球裂解不完全,需采用灭菌双蒸水重复洗涤;收集沉淀物,继续 进行核酸提取,或置-20℃贮存备用。 取1mL~2mL血清、菌液样品,15000×g离心10min,弃上清,加1mL0.01mol/LpH7.6PBS, 充分振荡混匀,15000×g离心10min;弃上清,收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置-20℃备用。 3GB/T27637—2011 8.1.2 奶样前处理 取10mL奶液,加100μLTritonX-100,振荡混匀,2500×g离心20min;弃上清,取沉淀,加1mL 0.01mol/LpH7.6PBS,充分振荡混匀,将沉淀悬浮液移入微量离心管,15000×g离心10min;弃上 清,收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置-20℃贮存备用。 8.1.3 粪样前处理 取粪样1g~2g,按1∶5的比例加入4%硫酸溶液(例如1g粪样,加5mL液体)充分振荡混匀,室 温静置0.5h~1h;取上层约3mL液体(避免吸取粗渣),5000×g离心1min,取上清,15000×g离心 10min;弃上清,加等量0.01mol/LpH7.6PBS,振荡混匀,使沉淀充分悬浮,15000×g离心10min;弃 上清,重复本步骤1次;收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置-20℃贮存备用。 8.1.4 组织样品前处理 取适量组织样品(剔除脂肪、被膜),剪碎,按1∶5的比例加入柠檬酸钠-磷酸缓冲液(例如,1g组织 样品,加入5mL缓冲液),充分研磨;加等量4%氢氧化钠溶液,继续研磨5min~10min,使组织液化; 充分振荡,75℃温浴0.5h~1h;取上清(避免吸取粗渣),15000×g离心10min;弃上清,加等量 0.01mol/LpH7.6PBS,振荡混匀,使沉淀充分悬浮,15000×g离心10min,弃上清,重复本步骤1次; 收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置-20℃贮存备用。 8.2 核酸提取 在上述已完成前处理的样品(沉淀物)中加入50μL~100μLDNA提取液,充分振荡混匀,56℃温 浴30min,98℃~100℃加热10min,瞬时离心使液滴聚集管底,加等体积三氯甲烷,振荡混匀, 12000×g离心5min,取上清,直接用于PCR或贮存于-80℃备用(适用于除粪样外的其他样品)。粪 样样品还需进行以下步