ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27634—2011 传 染性囊病病毒核酸检测方法 Protocolofnucleicaciddetectionforinfectiousbursaldisease (gumborodisease)virus 2011-12-30发布 2012-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、华南农业 大学、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、北京盈九思科技有限公司。 本标准主要起草人:秦智锋、孙洁、卢体康、花群义、陈书琨、吕建强、杨素、方兴旺、曾少灵、詹爱军、 毕英佐、陈兵、阮周曦、朱玉兰。 ⅠGB/T27634—2011 传染性囊病病毒核酸检测方法 1 范围 本标准规定了传染性囊病病毒RT-PCR检测方法和实时荧光RT-PCR检测方法的技术要求和操 作规范。 本标准适用于传染性囊病病毒感染的快速诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088 出入境动物检疫采样 GB19489 实验室 生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值:荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。 IBD:infectiousbursaldisease,传染性囊病。 IBDV:infectiousbursaldiseasevirus,传染性囊病病毒。 SPF:specificpathogenfree,无特定病原体。 4 材料与试剂 4.1 仪器与耗材 4.1.1 核酸电泳仪。 4.1.2 凝胶成像仪。 4.1.3 冷冻离心机(最高离心力达15000g以上)。 4.1.4 混匀器。 4.1.5 冰箱(2℃~8℃,-20℃,-80℃)。 4.1.6 微量可调移液器(10μL,100μL,1000μL)。 4.1.7 微量带滤芯吸嘴(10μL,100μL,1000μL)。 4.1.8 灭菌研钵。 4.1.9 离心管。 4.1.10 PCR光学反应管。 4.1.11 PCR仪。 4.1.12 实时荧光PCR仪。 1GB/T27634—2011 4.2 试剂 4.2.1 试剂级别:除另有规定,本方法试验用水应符合GB/T6682规定的二级水,所用化学试剂均为 分析纯。 4.2.2 引物与探针:采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100μmol/L储存液,置 -20℃或更低温度冻存;使用时取适量配制成10μmol/L工作液,避免多次冻融。 4.2.3 灭菌双蒸水。 4.2.4 三氯甲烷。 4.2.5 异丙醇。 4.2.6 无水乙醇。 4.2.7 75%乙醇:用新开启的灭菌双蒸水配制,-20℃预冷。 4.2.8 DL2000DNAMarker。 4.2.9 一步法RT-PCR检测试剂盒。 4.2.10 一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒。 5 生物安全要求 5.1 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作,应遵守GB19489的有关规定。 5.2 IBDV核酸检测方法的实验室规范(参见附录A)。 6 样品的采集 6.1 按照GB/T18088的要求进行样品的采集。 6.2 样品包括各种病料、用于IBDV监测和检测的禽组织、IBDV的细胞培养液、IBDV接种鸡胚的尿 囊液等。 7 核酸抽提 7.1 酚三氯甲烷抽提法 7.1.1 取灭菌的1.5mL离心管,做好标识。 7.1.2 每管加入600μL裂解液,分别加入被检样本、阴性对照(SPF鸡的法氏囊组织PBS研磨上清 液)、阳性对照(标准的IBDV毒株)各200μL,再加入200μL三氯甲烷,混匀器上振荡混匀5s,于4℃ 12000g离心15min。 7.1.3 取无RNA酶的1.5mL离心管,加入-20℃预冷400μL异丙醇,吸取本标准7.1.2各管中的 上清液转移至相应的管中,避免吸出中间层,颠倒混匀。 7.1.4 于4℃12000g离心15min,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体;加入600μL75%预冷乙醇, 洗涤。 7.1.5 于4℃12000g离心10min,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体。 7.1.6 10000g离心10s,用微量加样器将其吸干,室温干燥5min~10min。 7.1.7 加入15μL无核酸降解酶的水,溶解管底的RNA,5000g离心5s,冰上保存备用。若需长期保 存应放置-70℃冰箱。 2GB/T27634—2011 7.2 其他核酸抽提法 核酸提取可以采用等效RNA提取试剂及方法,如采用自动化核酸抽提工作站来抽提核酸。 8 RT-PCR检测 8.1 引物 8.1.1 针对A片段VP2基因的引物 上游U3:5’-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GCA-TGC-GGT-ATG-TGA-GGC-TTG-GTG-AC-3’ 下游L3:5’-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-GAA-TTC-GAT-CCT-GTT-GCC-ACT-CTT-TC-3’ 8.1.2 针对B片段VP1基因的引物 上游+290:5’-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GAA-TTC-AGA-TTC-TGC-AGC-CAC-GGT-CTC-T-3’ 下游-861:5’-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-CTG-CAG-TTG-ATG-ACT-TGA-GGT-TGA-TTT-TG-3’ 8.1.3 引物组成的说明 8.1.3.1 通用引物M13或R13(黑体部分)序列。M13或R13序列为多数测序反应中的测序引物,便 于对PCR扩增产物测序。 8.1.3.2 限制性内切酶位点(下划线部分)。限制性内切酶位点的引入,使得IBDV经RT-PCR扩增 后的产物可用限制性内切酶SphI(引物U3)、EcoRI(引物L3和+290)、PstI(引物-861)进行酶切后加 入质粒中。引物U3和L3分别对应AccNoX84034毒株序列片段A的657-676和1193-1212位 置,引物+226和-793分别对应AccNoAF240687毒株序列片段B中的290-311和861-883位置。 8.1.3.3 IBDV特异性序列(斜体部分)。A片段扩增产物为604bp,B片段扩增产物为642bp,引物 扩增片段适合进行IBDV分子分析和分子流行病学研究。 8.2 反应液的配制 按照商业化的一步法RT-PCR试剂盒推荐说明书,进行IBDVRT-PCR反应液的配制(参见附录B)。 将配制的每个PCR反应试剂充分混匀,瞬时离心后转移至样本处理区。 8.3 加样 在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸5μL,混匀后瞬时离心,将 PCR管放入PCR检测仪内,记录样本放置顺序。 8.4 PCR扩增检测 8.4.1 在扩增检测区进行。 8.4.2 PCR反应条件为: 第一步:反转录50℃45min; 第二步:94℃5min(如果为热启动一步法RT-PCR试剂盒,则需要95℃15min); 第三步:94℃30s,54℃45s,72℃1min30s,5个循环; 第四步:94℃30s,64℃45s,72℃1min30s,30个循环; 第五步:72℃延伸10min。 3GB/T27634—2011 8.5 上样和电泳 配制凝胶(见附录C)。将样品的扩增产物按编号加入对应的1%琼脂糖凝胶的各孔中,其中一个 上样孔中加入标准阳性对照扩增产物,一个上样孔中加入标准阴性对照扩增产物。在凝胶的边孔中加 入标准分子质量的DNAMarker。将凝胶在80V恒定电压下电泳60min。将凝胶置紫外灯或凝胶成 像仪中进行检查。 8.6 结果判定 8.6.1 阳性 出现一条分子质量为604bp条带,与阳性对照PCR产物同步迁移的大小相同条带,判为IBDV片 段A核酸阳性。出现一条分子质量为642bp条带,与阳性对照PCR产物同步迁移的大小相同条带,判 为IBDV片段B核酸阳性。片段A和片段B同时出现核酸阳性,可以判定IBDV阳性。 8.6.2 阴性 片段A和片段B同时出现核酸阴性,IBDV判为阴性。 8.6.3 可疑 在片段A和片段B的核酸检测中,只出现其中一个片段为阳性,另一个片段为阴性,则判定为 IBDV可疑。结果可疑应进行实时荧光RT-PCR检测;或重复进行RT-PCR检测,出现A和B两个片 段中任何一个片段判定为阳性,否则判定为阴性。 9 实时荧光RT-PCR检测 9.1 引物和探针 9.1.1 针对A片段VP2基因的引物 上游引物:5’TTCATACGGAGCCTTCTGAT3’; 下游引物:5’ACAATTAGCCCTGACCCT3’。 9.1.2 TaqMan探针:5’FAM-CAACCGGACCGGCGTCCATTC-BHQ3’,其5’端和3’端分别标记 FAM和BHQ。 9.2 扩增检测 9.2.1 扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行。按照商业化的一步法实时荧光RT-PCR(realtimeRT-PCR)试剂盒推 荐说明书,进行IBDVrealtimeRT-PCR反应液的配制(参见附录D)。将配制的每个PCR反应试剂充 分混匀,瞬时离心后转移至样本处理区。 9.