ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27539—2011 动 物流感检测 A型流感病毒 通用荧光RT-PCR检测方法 Animalinfluenzadetection—Methodofreal-timeRT-PCRfordetectionof influenzavirusA 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫 局、深圳匹基生物工程有限公司。 本标准主要起草人:汪琳、林志雄、周琦、高志强、陈茹、乔彩霞、蒲静、杨伟、梁成珠。 ⅠGB/T27539—2011 动物流感检测 A型流感病毒 通用荧光RT-PCR检测方法 1 范围 本标准规定了A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测的操作方法。 本标准适用于活动物及其产品中A型流感病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T27401 实验室质量控制规范 动物检疫 SN/T1330 进出口生、熟毛皮检验规程 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值:每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(Ctvalue) DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) PBS:磷酸盐缓冲液(配方见附录A)(phosphatebuffersaline) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RT-PCR:反转录-聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction) 4 原理 流感病毒(influenzavirus)属正粘病毒科,根据抗原特性及其基因特性的不同,流感病毒分为甲 (A)、乙(B)、丙(C)型。乙型变异性较弱、丙型抗原性比较稳定,仅感染人类;甲(A)型抗原变异性最强, 感染人类和其他动物,常引起世界性大流行。编码基质蛋白的M基因是A型流感病毒共有且较保守。 采用Taqman技术,针对M基因中特定序列,合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针,探 针的5′端标记报告荧光基团(R),3′端标记淬灭荧光基团(Q)。在PCR退火阶段,一对引物和一条探针 同时与目的基因片段结合,探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到R所发出的 荧光信号;在PCR延伸阶段,Taq酶在引物的引导下沿着模板链合成新链,当链的延伸进行到探针结合 部位时,受到探针的阻碍而无法继续,Taq酶发挥5′→3′外切核酸酶的功能,将探针水解成单核苷酸,标 记在探针上的R基团就游离出来,R所发出的荧光不为Q所吸收而被检测仪所接收,随着PCR反应的 进行,PCR产物量与荧光信号呈现正比关系。 1GB/T27539—2011 5 材料与试剂 5.1 仪器设备 5.1.1 荧光PCR检测仪。 5.1.2 高速微型离心机(离心速度12000r/min以上)。 5.1.3 台式高速离心机(离心速度3000r/min以上)。 5.2 试剂 5.2.1 除特别说明以外,本标准所用试剂均为分析纯,实验室用水符合GB/T6682的要求。所有试剂 均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。 5.2.2 DEPC水(见附录B)。 5.2.3 Trizol。 5.2.4 氯仿。 5.2.5 异丙醇:-20℃预冷。 5.2.6 PBS:(121±2)℃,15min高压灭菌冷却后,无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000U/mL。 5.2.7 75%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水配制,-20℃预冷。 5.2.8 A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测引物、探针序列、反应液体系组成及使用注意事项见 附录B。 6 抽样 6.1 采样工具 下列采样工具应该经(121±2)℃,15min高压灭菌并烘干: ———棉拭子; ———剪刀; ———镊子; ———注射器; ———1.5mL离心管; ———研钵。 6.2 样品采集 6.2.1 活动物 取鼻拭子、咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下: ———取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮2次~3次并旋转,取鼻腔分泌液; ———取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮2次~3次并旋转,取咽喉分泌液; ———取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便; ———将采样后的拭子分别放入盛有1.0mLPBS的1.5mL离心管中,加盖、编号。 6.2.2 脏器或肌肉组织 用无菌镊子采集待检脏器或肌肉组织,装入一次性塑料袋或其他灭菌容器,编号。 2GB/T27539—2011 6.2.3 血清、血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中,编号备用。 6.2.4 动物皮 采样方法按照SN/T1330,将待检样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器,编号。 6.3 样品贮运 样品采集后,放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋),于保温箱中加冰、密封, 24h内送实验室。 6.4 样品处理 6.4.1 拭子 样品在混合器上充分混合后,用灭菌镊子将拭子中的液体挤出,3000r/min离心5min,吸取上清 液1mL转入无菌的1.5mL离心管中备用。 6.4.2 脏器或肌肉组织 取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨,加10mLPBS混匀,4℃,取上清液 1mL转入无菌的1.5mL离心管中,编号备用。 6.4.3 动物皮 先用消毒的镊子、剪刀将动物皮剪成1mm3大小的颗粒,称取2.0g于无菌的研钵中,加液氮充分 研磨后,加10mLPBS混匀,4℃,3000r/min离心5min,取上清液1mL转入无菌的1.5mL离心管 中,编号备用。 6.5 样品存放 制备的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h,若需长期保存应置-70℃以下,但应避免反 复冻融(冻融不超过3次)。 7 操作方法 7.1 实验室设置标准与生物安全管理 A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测按照GB/T27401,GB19489,GB/T19495.2的规定。 7.2 样品核酸提取 7.2.1 在样品制备区进行。取n个灭菌的1.5mL离心管,其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照 的和,编号。 7.2.2 每管加入600μLTrizol,分别加入被检样品、阴性对照、阳性对照各200μL,混匀,再加入 200μL氯仿,上下颠倒混匀。于4℃、12000r/min离心15min。 7.2.3 取与7.2.1相同数量灭菌的1.5mL离心管,加入等体积异丙醇(-20℃预冷),做标记。吸取 本标准7.2.2各管中的上清液转移至相应的管中,吸取上清液,不能吸出中间层,颠倒混匀。 3GB/T27539—2011 7.2.4 于4℃、12000r/min离心15min,小心倒去上清,加入600μL75%乙醇(-20℃预冷),颠倒 洗涤。 7.2.5 于4℃、12000r/min离心10min,小心倒去上清,晾干。 7.2.6 加入11μLDEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000r/min离心5s,冰上保存备用。提 取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增,若需长期保存应放置-70℃冰箱。 7.3 检测 7.3.1 扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行。 荧光RT-PCR反应液体系组成见附录B,充分混匀后,转移至样品处理区。 7.3.2 加样 在样品处理区进行。 在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入样品处理7.2.6中制备的RNA溶液各10μL,盖紧管盖, 500r/min离心30s。 7.3.3 荧光RT-PCR反应 在检测区进行。 将本标准7.3.2中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内,记录样品摆放顺序。 循环条件设置: 第一阶段,反转录42℃、30min。 第二阶段,预变性92℃、3min。 第三阶段,92℃、10s,45℃、30s,72℃、1min,5个循环。 第四阶段,92℃、10s,60℃、30s,40个循环,在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。 试验检测结束后,根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。 8 结果判定 8.1 结果分析条件设定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过正常阴性样品 扩增曲线的最高点为准。 8.2 质控标准 8.2.1 阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。 8.2.2 阳性对照的Ct值应小于28.0,并出现典型的扩增曲线。 8.2.3 当8.2.1和8.2.2都成立时,此次试验才有效;否则,此次试验视为无效。 8.3 结果描述及判定 8.3.1 阴性 无Ct值并且无扩增曲线,判为阴性。 4GB/T27539—2011 8.3.2 阳性 Ct值小于30,且出现典型的扩增曲线,判为阳性。 8.3.3 有效原则 Ct值大于30的样品建议重做。重做结果无Ct值者为阴性,否则为阳性。 5GB/T27539—2011 附 录 A (规范性附录) 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)配方 A.1 A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液) NaH2PO4·