ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27538—2011 动 物流感检测 A型H1N1流感病毒中 HA、NA的焦磷酸测序检测方法 Animalinfluenzadetection—MethodofpyrosequencingforHAandNAin influenzavirusA(H1N1) 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:徐彪、梁成珠、凌宗帅、张太翔、岳志芹、高宏伟、孙涛、方绍庆、林祥梅、韩雪清、 朱来华、张鹤晓、单虎。 ⅠGB/T27538—2011 动物流感检测 A型H1N1流感病毒中 HA、NA的焦磷酸测序检测方法 1 范围 本标准规定了焦磷酸测序技术用于A型H1N1流感病毒及其墨西哥变异株中的HA和NA核酸 序列检测方法。 本标准适用于A型H1N1流感病毒通用及A型H1N1流感病毒墨西哥变异株的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088 出入境动物检疫采样 GB19489 实验室生物安全通用要求 NY/T541 动物疫病实验室检验采样方法 SN/T1193 基因检验实验室技术要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ATP:三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) PBS:磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebelancedsolution) Pyrosequencing:焦磷酸测序 RT-PCR:反转录聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) Taq酶:TaqDNA聚合酶 4 原理 焦磷酸测序是通过测序引物和PCR扩增单链DNA模板杂交,与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧 光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物(APS)、荧光素孵育,逐一加入四种dNTPs(dATP,dTTP,dCTP, dGTP),如与模板配对,此dNTP与引物的末端形成共价键,释放焦磷酸基团(PPi);ATP硫酸化酶在 APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化,氧化荧 光素发出与ATP量成正比的可见光信号;光信号由电荷耦合检测器(CCD)收集并由软件转化为峰。 每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸 酶降解,淬灭光信号,并再生反应体系。 1GB/T27538—2011 5 试剂和材料 5.1 除特别说明外,本标准所用试剂为分析纯或生化试剂,所有试剂均用无RNA酶污染的器具 (用DEPC水处理)分装,实验用水符合GB/T6682的规定。 5.2 焦磷酸测序用引物(对)序列见附录A。 5.3 AMV反转录酶。 5.4 TaqDNA聚合酶。 5.5 PyroGoldSQAReagentsDNA序列分析试剂盒或其他等效试剂。 5.6 DNTPs。 5.7 琼脂糖(电泳纯)。 5.8 三氯甲烷。 5.9 异丙醇。 5.10 70%乙醇:配制方法见附录B。 5.11 DNA分子量标准品(100bp~2000bp)。 5.12 裂解液:Trizol或其他等效总RNA提取试剂。 5.13 PBS:配制方法见附录B。 5.14 10×PCR缓冲液:建议使用厂家提供,如需配制见附录B。 5.15 电泳缓冲液:配制方法见附录B。 5.16 溴化乙锭贮存液:用水配制成10mg/mL。 5.17 电泳加样缓冲液:配制方法见附录B。 5.18 磁珠悬液。 6 仪器设备 6.1 焦磷酸测序仪。 6.2 焦磷酸测序仪96孔板。 6.3 真空吸附器。 6.4 PCR仪。 6.5 冷冻离心机(最大离心力12000g以上)。 6.6 微量移液器。 6.7 电泳仪。 6.8 紫外检测仪。 6.9 1.5mLEppendorf管。 7 采样和样品制备 7.1 采样 按照NY/T541和GB/T18088选取样品。样品处理和其他实验活动符合GB19489的有关规定。 7.2 样品处理 7.2.1 鼻腔拭子 样品在混合器上充分混合后,用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出,3000g离心5min,取上清液 2GB/T27538—2011 转入无菌的1.5mLEppendorf管中,编号备用。 7.2.2 肌肉或组织脏器 取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨,加10mLPBS混匀,4℃, 3000g离心15min,根据需要取上清液转入无菌的1.5mLEppendorf管中,编号备用。 7.3 样本存放 制备的样本在2℃~8℃条件下保存应不超过24h,若需长期保存应置-70℃以下,但应避免反 复冻融(冻融不超过3次)。 8 操作方法 8.1 病毒RNA的提取 8.1.1 取灭菌的1.5mLEppendorf管,编号。 8.1.2 用微量移液器向每管中各加入600μL裂解液,分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各 200μL,混匀后再加入200μL三氯甲烷,混匀器上振荡混匀30s。于4℃12000g离心15min。 8.1.3 取与8.1.1相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管,加入-20℃预冷的500μL异丙醇,做标 记。吸取本标准8.1.2各管中的上清液转移至相应的管中,上清液应至少吸取500μL。 8.1.4 于冷冻离心机上4℃12000g离心15min,小心倒去上清,倒置于吸水纸上,吸干液体; 加入600μL70%乙醇,颠倒洗涤。 8.1.5 于4℃12000g离心10min,小心倒去上清,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体,室温干燥。 8.1.6 加入10μLDEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000g离心5s,冰上保存备用。提取的 RNA应在2h内进行PCR扩增;若需长期保存须放置-70℃冰箱。 8.2 RT-PCR扩增 8.2.1 反转录 在3μL模板中分别加入2μL25mmol/LMgCl2,1μL10×PCR缓冲液,1μL 2.5mmol/LdNTP,0.25μL40U/μLRNA酶抑制剂,0.5μL5U/μLAMV反转录酶,0.5μL 20pmol/μL焦磷酸测序引物对(见附录A)中的RT-PCR上下游引物,用DEPC水补足体积至10μL, 瞬时离心混合。在PCR仪上进行反转录,条件为42℃30min,98℃1min,冷却到4℃。 8.2.2 PCR反应 8.2.2.1 PCR反应体系 在反转录后的10μLcDNA溶液中加入10×PCR缓冲液5μL,5U/μLTaqDNA聚合酶 0.25μL,20pmol/μL焦磷酸测序引物对(见附录A)中的RT-PCR上下游引物各0.5μL,DEPC水补 足体积至50μL,在PCR仪上扩增。 8.2.2.2 PCR循环条件 8.2.2.2.1 A型H1N1流感病毒HA基因:94℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s, 72℃延伸30s,共循环45次;然后72℃再延伸10min。 8.2.2.2.2 A型H1N1流感病毒NA基因:94℃预变性5min,94℃变性30s,56℃退火30s, 3GB/T27538—2011 72℃延伸30s,共循环45次;然后72℃再延伸10min。 8.2.2.2.3 A型H1N1流感病毒墨西哥株HA基因:94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火 30s,72℃延伸30s,共循环45次;然后72℃再延伸10min。 8.2.2.2.4 A型H1N1流感病毒墨西哥株NA基因:94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火 30s,72℃延伸30s,共循环45次;然后72℃再延伸10min。 8.2.3 对照系统 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。 8.3 PCR扩增产物电泳检测 在电泳槽中加入电泳缓冲液,使液面刚刚没过含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶;将3μL~6μLPCR扩 增产物分别和适量电泳加样缓冲液混合,点样;以DNA分子量标准品做对照;9V/cm恒压电泳,直至 溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部;紫外检测仪下观察电泳结果并记录;扩增到目标片段的PCR产物用于 测序。 8.4 焦磷酸测序 8.4.1 测序单链模板的制备 8.4.1.1 测序使用焦磷酸测序专用试剂盒或其他等效试剂。 8.4.1.2 在焦磷酸测序仪96孔板中每孔预先加入44μL退火缓冲液,1μL20pmol/μL测序引物, 混匀。 8.4.1.3 混匀磁珠悬液,将需要使用的磁珠总量(按每样3μL)转移到一个1.5mLEppendorf管中, 加入结合缓冲液,使得平均每样达50μL。 8.4.1.4 将50μL标记有生物素的PCR产物与50μL链霉亲和素包被的磁珠混合,在室温25℃下振 荡孵育20min。 8.4.1.5 用真空吸附器将与磁珠结合后的PCR产物吸起,然后在纯水中清洗30s