ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27536—2011 猪 流感病毒分离与鉴定方法 Isolationandidentificationofswineinfluenzavirus 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 本标准主要起草人:乔传玲、杨焕良、陈艳、辛晓光、陈化兰。 ⅠGB/T27536—2011 猪流感病毒分离与鉴定方法 1 范围 本标准规定了猪流感病毒分离与鉴定方法。 本标准适用于各种亚型猪流感的病原分离和鉴定。 2 试验材料、试剂 2.1 剪刀、镊子。 2.2 1mL注射器。 2.3 单道及多道微量移液器、吸头。 2.4 9~11日龄SPF鸡胚。 2.5 犬肾细胞(MDCK)。 2.6 6孔培养板。 2.7 DMEM培养基。 2.8 HEPES缓冲液(1mol/L储存液)。 2.9 胎牛血清。 2.10 TPCK-胰蛋白酶(胰蛋白酶经TPCK处理)。 2.11 0.01mol/LpH7.0~7.4磷酸盐缓冲液(PBS)(参见附录A中A.1)。 2.12 磷酸盐缓冲液(pH5.9)(参见附录A中A.5)。 2.13 0.85%生理盐水(参见附录A中A.2)。 2.14 阿氏(Alsevers)液(参见附录A中A.3)。 2.15 0.5%红细胞悬液(参见附录A中A.4)。 2.16 胎球蛋白(参见附录A中A.6)。 2.17 过碘酸盐(参见附录A中A.7)。 2.18 亚砷酸盐(参见附录A中A.8)。 2.19 硫代巴比妥酸(参见附录A中A.9)。 2.20 无菌蒸馏水或去离子水。 3 仪器 3.1 生物安全柜(柜内负压,有HEPA过滤器可避免细胞培养物污染及保护操作人员安全)。 3.2 孵化器。 3.3 CO2培养箱。 3.4 台式高速冷冻离心机。 3.5 37℃水浴加热器。 3.6 煮沸锅。 3.7 棉拭子(医用棉签)。 3.8 研磨器。 1GB/T27536—2011 4 样品采集与处理 4.1 样品的采集 病死猪,取肺脏或气管分泌物;待检活猪,用棉拭子(医用棉签)采集鼻腔深部分泌物。 4.2 样品的保存 样品应置于特定的样品保存液中进行保存。一般采用磷酸盐缓冲液(pH7.0~7.4,0.01mol/L)、 0.85%生理盐水或者不含血清的细胞培养液作为保存液(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000IU/ mL、制霉菌素1000IU/mL,牛血清白蛋白5mg/mL)。样品采集后应置于加冰的保温箱中、密封, 24h内送至实验室进行处理或置-70℃保存。 4.3 样品的处理 用剪刀采组织病料置于研磨器中,按质量体积比(1∶1)加入样品保存液进行研磨;将棉拭子置于装 有1mL样品保存液的离心管中,用镊子充分挤压后弃去拭子。以上样品室温静置作用30min,4℃ 3000r/min离心5min,取上清作为接种材料。 5 样品接种 5.1 鸡胚培养 1mL注射器吸取处理好的样品,以0.2mL/胚的量经尿囊腔和羊膜腔途径接种9~11日龄SPF 鸡胚,每个样品接种3个胚,于35℃~37℃孵化箱内孵育72h~96h,弃去24h内死亡鸡胚。孵化至 96h将鸡胚制冷后,无菌收取24h以后死亡鸡胚及96h仍存活鸡胚的尿囊液和羊水。 5.2 细胞培养 在生物安全柜中操作,将60%~80%长满单层的MDCK细胞的6孔细胞培养板用细胞培养液(不 含胎牛血清,含有TPCK处理的胰酶2μg/mL的DMEM培养基)洗三次,加入适量的处理样品,置于 5%CO2、37℃培养箱中培养1h~2h,期间每隔30min轻轻摇动一次。感作完毕,弃去感作物,用含 有胰酶的培养液洗三次,加入适量的细胞维持液,5%CO2,37℃培养箱内继续培养5d~7d,期间观察 细胞病变(CPE)的形成情况。如出现CPE(特征病变为:细胞肿胀圆化,细胞间隙增大,细胞核固缩或 破裂,严重时细胞部分或全部脱落),收集细胞培养上清。 5.3 结果判定 收获鸡胚液或细胞培养上清,测定其血凝活性(具体操作见6.1)。若HA反应阳性说明可能有粘 病毒科的病毒,应采用HA-HI试验进行血凝素亚型的鉴定;若无血凝活性或血凝价很低,应盲传3~5代, 若仍阴性,则认为病毒分离阴性。 6 亚型鉴定 6.1 HA试验 6.1.1 在微量反应板的1~12孔均加入0.05mLPBS,换吸头。 6.1.2 吸取0.05mL待鉴定病毒液,加入第1孔,反复抽打3~5次混匀。 2GB/T27536—2011 6.1.3 从第1孔吸取0.05mL病毒液加入第2孔,混匀后吸取0.05mL加入第3孔,如此进行对倍稀 释至第11孔,从第11孔吸取0.05mL弃之,换吸头。第12孔作为红细胞对照。 6.1.4 每孔均加入0.05mL0.5%(体积分数)鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)。 6.1.5 轻轻混匀,室温(20℃~25℃)下静置10min~30min后观察结果(如果环境温度太高,可置 4℃环境下)。对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果。 6.1.6 结果判定:将反应板倾斜45°,观察红细胞若没有呈泪滴状流淌,则判为HA阳性;完全血凝(不 流淌)的病毒最高稀释倍数为病毒的HA效价(血凝单位用HAU表示)。反之,判为HA阴性。 6.2 HI试验 6.2.1 标定参考毒株抗原及待鉴定病毒分别为4HAU(25μL)。 6.2.2 在微量反应板的第1~11孔加入0.025mLPBS,第12孔加入0.05mLPBS。 6.2.3 加0.025mL标准阳性血清至第1孔,充分混匀后吸出0.025mL于第2孔,依次对倍稀释至第 11孔,从第11孔吸取0.025mL弃去。 6.2.4 1~11孔均分别加入0.025mL4HAU参考毒株抗原及待鉴定病毒,第12孔作为红细胞对照。 室温(20℃~25℃)下静置10min~30min。 6.2.5 每孔均加入0.05mL0.5%(体积分数)鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入),轻轻混 匀,室温(20℃~25℃)下静置10min~30min后,观察结果(对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果)。 6.2.6 结果判定:按照HA试验进行结果判定。如果待鉴定病毒样品的血凝活性被这一亚型阳性血 清所抑制,则该样品判为这一血凝素亚型阳性。(检测结果成立的条件:已知抗原与相应的阳性血清反 应后出现预期的HI效价,同时抗原的反馈标定结果均为4HAU;反之试验重新进行。) 6.3 NI试验(全量法以N1和N2分型血清为例) 6.3.1 将N1、N2标准阳性血清和阴性血清分别按原液、10倍、100倍稀释,并分别加入标记好的相应 试管中。 6.3.2 将已经确定HA亚型的待检病毒液稀释至HA价为16HAU,每管均加入0.05mL,混匀37℃ 水浴1h。 6.3.3 每管加入的胎球蛋白溶液(50mg/mL)0.1mL,混匀,拧上盖后37℃水浴16h~18h。 6.3.4 室温冷却后,每管加入0.1mL过碘酸盐混匀,室温静置20min。 6.3.5 每管加入1mL砷试剂(参见附录A中A.8),振荡至棕色消失、乳白色出现。 6.3.6 每管加入2.5mL硫代巴比妥酸试剂(参见附录A中A.9),将试管置煮沸的水浴中15min,不 出现粉红色的为神经氨酸酶抑制阳性,即待检病毒的神经氨酸酶亚型与加入管中的标准神经氨酸酶分 型血清亚型一致。 7 注意事项 7.1 标准抗原稀释液浓度为4个HAU,并且在每次试验前进行标定。 7.2 孵育时间要严格控制。红细胞对照完全沉淀时要迅速判读。在一些病毒株中可见红细胞从病毒 中解脱,如果有这种情况的发生,要提前判定或置4℃下孵育。 7.3 红细胞悬液始终符合标准。 7.4 反应试剂要按规定保存和使用。为避免反复冻融和细菌污染,应以无菌操作将试剂分装成小 包装。 7.5 冻干的试剂应按照说明书中规定的体积重新溶解并保存。 7.6 操作过程生物安全注意事项见附录B。 3GB/T27536—2011 附 录 A (资料性附录) 相关试剂的配制 A.1 0.01mol/LpH7.0~7.4PBS NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.42g KH2PO4 0.27g 灭菌双蒸水 800mL NaOH或者HCl调pH7.0~7.4,灭菌双蒸水加至1000mL定容,121℃高压灭菌15min或过滤 除菌。 A.2 0.85%生理盐水 NaCl8.5g,加灭菌双蒸水1000mL定容,121℃高压灭菌15min或过滤除菌。 A.3 阿氏(Alsevers)液 葡萄糖 2.05g 柠檬酸钠 0.8g 柠檬酸 0.055g 氯化钠 0.42g 灭菌双蒸水 至100mL NaOH或者HCl 调pH6.1 121℃高压灭菌15min,2℃~8℃保存备用。 A.4 0.5%红细胞悬液 采集SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合,用PBS液洗涤 3次,以3000r/min离心5min,洗涤后用PBS配成0.5%(体积分数)红细胞悬液,2℃~8℃保存 备用。 A.5 PBS,pH5.9 A溶液[0.4mol/L磷酸二氢钠(NaH2PO4)]:称取27.6gNaH2PO4,溶于5