ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27531—2011 病 毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合 酶链式反应(RT-PCR)检测方法 Protocolofreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR) forthepathogenofviralencephalopathyandretinopathy 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:刘荭、卢体康、何俊强、史秀杰、郑晓聪、贾鹏、叶奕优、杨锦舜。 ⅠGB/T27531—2011 病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合 酶链式反应(RT-PCR)检测方法 1 范围 本标准规定了病毒性脑病和视网膜病(viralencephalopathyandretinopathy,VER)病原分离和逆 转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法。 本标准适用于VER病原的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088 出入境动物检疫采样 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE:细胞病变(cytopathiceffect) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethyammoniumbromide) DEPC:焦碳酸乙二酯(diethypyrocarbonate) EB:溴化乙锭(ethidiumbromide) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) HEPES:羟乙基呱嗪乙硫磺酸[4-(2-hydroxyerhyl)piperazine-1-erhanesulfonicacid] RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RNasin:核酸酶抑制剂(ribonucleaseinhibitor) VER:病毒性脑病和视网膜病(viralencephalopathyandretinopathy) 4 试剂和材料 4.1 水:符合GB/T6682中一级水的规格,用DEPC处理以除掉RNA酶。 4.2 VERV病毒参考株。 4.3 胰酶-EDTA混合消化液(见附录A中A.1)。 4.4 L-15培养液(见附录A中A.2)。 4.5 SSN-1细胞系:用L-15培养液25℃培养。 4.6 E-11细胞系:用L-15培养液25℃培养。 4.7 AMV逆转录酶:20U/μL,-20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.8 RNasin:20U/μL,-20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.9 胰蛋白酶。 1GB/T27531—2011 4.10 Taq酶:-20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.11 dNTP:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。 4.12 引物:用于RT-PCR反应的引物浓度为40μmol/L。其序列如下: VERV-F:5′-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3′ VERV-R:5′-CGAGTCAACACGGGTGAAGA-3′ 4.13 乙醇:分析纯,使用前预冷到-20℃。 4.14 氯仿:分析纯。 4.15 矿物油:要求无DNA酶和RNA酶,用于无热盖的PCR扩增仪。 4.16 分子量标准。 5 器材和设备 5.1 96孔细胞培养板。 5.2 倒置显微镜。 5.3 恒温培养箱。 5.4 普通冰箱和超低温冰箱。 5.5 组织研磨器(研磨器处理参见附录B)。 5.6 离心机和离心管(离心管处理参见附录B)。 5.7 PCR扩增仪。 5.8 水平电泳仪。 5.9 微量移液器及吸头(吸头处理参见附录B)。 5.10 紫外照射仪或凝胶成像仪。 5.11 制冰机。 6 VERV的分离 6.1 采样 待检测鱼,体长小于4cm的鱼苗取整条鱼,体长4cm~6cm的鱼苗取头部和内脏(包括肾),体长 大于6cm的鱼取脑、眼、脾和肾。按GB/T18088的标准采样。 6.2 样品处理 6.2.1 组织处理 用组织研磨器制备组织匀浆,按1∶10的最终稀释度用L-15培养液稀释,稀释液中含有1000IU/mL 青霉素和1000μg/mL链霉素,于15℃下孵育2h~4h或4℃下孵育6h~24h。7000r/min离心 15min,收集上清液。 6.2.2 病毒分离 细胞传代使用胰酶-EDTA混合消化液。对1∶10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释,然后将 1∶10、1∶100、1∶1000的3个稀释度的上清液以适当体积分别接种到两个生长约24hSSN-1或E-11 细胞单层的96孔板中,每孔的细胞单层最多接种100μL稀释液。15℃~20℃吸附0.5h~1h后,加 入L-15细胞培养液。两个96孔板分别置于20℃和25℃培养。设2个阳性对照(接种VERV标准 株)和1个空白对照(未接种病毒的细胞)。 2GB/T27531—2011 阳性对照和待测样品都接种细胞后,7d内每天用倒置显微镜检查。如果接种了被检匀浆上清稀 释液的细胞培养中出现细胞病变(CPE),应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外,没有CPE出现,则 在培养7d后还要用敏感细胞进行盲传。传代时,将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻 融一次,以7000r/min、4℃离心15min,收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层,培养7d。每天 用倒置显微镜检查。 如果阳性对照也未出现CPE,则应换用SSN-1或E-11细胞和待测样品重新进行病毒学检查。 7 VERV的RT-PCR检测 7.1 样品处理 将450μL细胞病变悬液冻融后,放入1.5mL的塑料离心管,再加入450μLCTAB溶液(见附录A中 A.3)并混匀,25℃作用2h。 7.2 核酸抽提 在含有样品的塑料离心管中加入600μL抽提液1(见附录A中A.4),用力混合至少30s。 12000r/min离心5min,小心取上层水相(约800μL)。再加入700μL抽提液2(见附录A中A.5), 用力混合至少30s。12000r/min离心5min,小心取上层水相(约600μL)。再加入-20℃预冷的 1.5倍以上体积的无水乙醇,倒置数次混匀后,-20℃8h以上沉淀核酸。12000r/min离心30min, 小心倒去上清液,倒置于吸水纸上,吸干液体。37℃干燥20min或抽真空干燥;最后加10μL水溶解 后,作为PCR模板。 7.3 变性和退火 在PCR管中加入10μL模板和5μL引物(VERV-F和VERV-R各2.5μL),置于70℃反应 5min。立即冰浴,低速离心约5s,使液体集中在底部。 7.4 cDNA合成 在上述反应管中继续加入dNTP2μL、5倍逆转录酶缓冲液5μL、RNA抑制剂1μL、逆转录酶 1μL、无菌蒸馏水1.5μL,低速离心后,覆盖50μL矿物油。 将PCR管置于PCR扩增仪。42℃60min反应制备模板的cDNA。反应结束后,70℃10min灭 活逆转录酶,立即冰浴。 7.5 PCR扩增 在上述反应管中再继续加入Taq酶1μL,dNTP1μL,反向引物和正向引物各1μL,25mmol/L 的MgCl2(见附录A中A.6)10μL、10倍Taq酶缓冲液(见附录A中A.7)10μL、加水到总体积 100μL。 混匀后低速离心,让矿物油在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。先94℃4min,再开始35次 循环(核酸变性94℃1min、引物退火58℃1min、延伸72℃1min),然后72℃下延伸10min,最后 4℃保温。 7.6 设立对照 7.6.1 在7.2中的样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。 7.6.2 取含有已知VERV的病毒标准株的病鱼组织悬液作为阳性对照。 7.6.3 采用未接种病毒的正常SSN-1细胞抽提核酸作为阴性对照。 3GB/T27531—2011 7.6.4 取等体积的水代替模板作为空白对照。 7.7 琼脂糖电泳 用TBE(见附录A中A.8)电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖(含1μg/mLEB,见附录A中A.9)平 板。将平板放入水平电泳槽,使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6μLPCR扩增产物和2μL溴酚蓝指示 剂溶液(见附录A中A.10)混匀后加入孔内。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照。5V/cm 电泳约0.5h,当溴酚蓝到达琼脂糖凝胶的底部时停止。 7.8 结果判定 7.8.1 用紫外照射仪或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。如阳性对照出现一条427bp的DNA 片段,阴性对照和空白对照没有该扩增带,则表明反应体系正常。 7.8.2 待测样品电泳后在相应427bpDNA位置上有带者,取PCR扩增产物进行测序,同参考序列 (参见附录C)进行比较,相似性达到95%以上,则判定为阳性。 4GB/T27531—2011 附 录 A (规范性附录) 试剂及其配制 A.1 胰酶-EDTA混合消化液 氯化钠(NaCl,分析纯) 0.8g 氯化钾(KCl,分析纯) 0.02g 磷酸二氢钾(KH2PO4,