ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27529—2011 马 接触传染性子宫炎诊断技术 Diagnostictechniquesforcontagiousequinemetritis 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录A、附录B、附录C为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国新疆出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人:朱来华、梁成珠、郑小龙、肖西志、邓明俊、辛学谦、谭乐义、方绍庆、王宫璞、 岳志芹、季新成、王群、孙涛、赵玉然。 ⅠGB/T27529—2011 马接触传染性子宫炎诊断技术 1 范围 本标准规定了马接触传染性子宫炎(contagiousequinemetritis,CEM)的诊断技术。 本标准适用于马接触传染性子宫炎的诊断和检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T4789.28—2003 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 临床检查 3.1 临床特征 公马感染马生殖道泰勒氏杆菌后不表现任何临床症状,当母马感染后表现阴道炎、子宫颈炎,初期 外阴部出现大量渗出物或灰色炎症分泌物,后期渗出物或分泌物逐渐变成黏稠的脓液,其中含有大量的 多核细胞、黏膜脱落细胞和崩解的细胞碎片。 3.2 判定 根据3.1临床检查可作出初步判定。为了确诊需进行实验室检查,细菌学检查是确诊本病最可靠 的方法。 4 病原分离与初步鉴定 4.1 材料准备 4.1.1 器材 4.1.1.1 微量移液器。 4.1.1.2 二氧化碳培养箱。 4.1.1.3 普通冰箱及低温冰箱(4℃、-20℃)。 4.1.1.4 离心管。 4.1.1.5 普通生物显微镜。 4.1.1.6 暗视野或相差显微镜。 4.1.1.7 载玻片。 4.1.1.8 接种环。 4.1.1.9 擦镜纸。 4.1.2 实验室用水 实验室用水是指实验室用于溶解、稀释或配制溶液的水,可用多次蒸馏或离子交换等制备,符合 GB/T6682二级水要求。 4.1.3 培养基 4.1.3.1 运输培养基:见附录A。 4.1.3.2 选择性琼脂培养基:见附录A。 1GB/T27529—2011 4.1.3.3 含硫酸链霉素(200μg/mL)选择性琼脂培养基:见附录A。 4.1.3.4 卵黄氯化钠琼脂培养基:见附录A。 4.1.4 试剂 4.1.4.1 除特别说明以外,本标准所用试剂均为分析纯。 4.1.4.2 革兰氏染色液:按GB/T4789.28—2003中2.2规定配制。 4.1.4.3 过氧化物酶试验试剂:按GB/T4789.28—2003中3.18规定,临用时配制。 4.1.4.4 氧化酶试验试剂:按GB/T4789.28—2003中3.20规定,临用时配制,于冰箱内避光保存。 4.2 样品采集和运送 在采集泌尿生殖道拭子前应至少停用抗生素药物7d,也不得使用消毒药物冲洗泌尿生殖道。 母马或公马保定后,用高压消毒的棉拭子刮擦泌尿生殖道黏膜(尿道隐窝、尿道窦、尿道或阴茎鞘) 以刮取含有细胞、分泌物的样品。从阴蒂窝和阴蒂窦刮取拭子进行分离培养即可证明马生殖道泰勒氏 杆菌的存在,但要获得纯净的培养物,应从子宫颈或子宫内膜中采集样品来分离。 公马:每匹公马分别从阴茎基部/包皮处(包皮垢)、尿道隐窝/尿道窦、尿道口采集3份拭子。 未怀孕母马:每匹母马分别从子宫颈、阴蒂隐窝、阴蒂窦采集3份拭子。 怀孕母马:每匹母马分别从阴蒂隐窝、阴蒂窦采集2份拭子。 棉拭子采集后,迅速插入装有1mL~2mL含活性炭的运输培养基离心管内,以吸附掉细菌代谢产 生的抑制因子。 在低温条件(2℃~8℃)下,样品尽快(24h~48h内)送往实验室。 4.3 病原分离培养 样品到达实验室后,立即用棉拭子蘸取样品液直接涂布于选择性琼脂培养基和含硫酸链霉素 (200μg/mL)选择性琼脂培养基平板上,每个拭子均接种2个平板。 平板在5%~10%的二氧化碳培养箱内35℃~37℃培养,最初24h应检查是否有杂菌污染。 48h后应每天观察,培养7d~14d。 4.4 病原初步鉴定 4.4.1 菌落鉴定 48h后应每天观察琼脂培养基。观察培养基上有无疑似特征性菌落。马生殖道泰勒氏杆菌的菌 落很小,直径2mm~3mm,边缘完整光滑,有光泽,呈浅灰黄色。如无特征性菌落,可弃之。 4.4.2 革兰氏染色鉴定 按GB/T4789.28—2003中2.2规定操作。 4.4.3 湿片动力试验 取干净载玻片一块,用微量移液器加一滴生理盐水,无菌挑取少量菌落,涂抹分散均匀。使用暗视 野或相差显微镜检查,先用低倍物镜,再用高倍物镜,观察细菌形态特征与动力特征。 4.4.4 生化鉴定 4.4.4.1 氧化酶试验 取典型菌落,按GB/T4789.28—2003中3.18规定操作。 4.4.4.2 过氧化氢酶试验 取典型菌落,按GB/T4789.28—2003中3.20规定操作。 4.4.4.3 磷脂酶试验 用接种环挑取固体培养基上典型菌落,点种于卵黄氯化钠琼脂平板(每张平板至少可接种10点), 在5%~10%的二氧化碳培养箱内37℃厌氧培养24h,观察接种点的变化。 磷脂酶试验阳性者产生卵磷脂酶,分解卵黄中的卵磷脂,接种点的底部及周围形成乳白色的混 浊带。 2GB/T27529—2011 4.5 结果判定 4.5.1 根据细菌的菌落特征、革兰氏染色特征、湿片动力试验、过氧化氢酶试验、磷脂酶试验和氧化酶 试验的结果可进行初步鉴定。 4.5.2 马生殖道泰勒氏杆菌生长缓慢,菌落很小,直经2mm~3mm,边缘完整光滑,有光泽,呈浅灰 黄色。 4.5.3 马生殖道泰勒氏杆菌革兰氏染色阴性,杆状或球杆状,有时呈多形态(长达6μm),并可表现两 极着色。 4.5.4 马生殖道泰勒氏杆菌无运动性。 4.5.5 马生殖道泰勒氏杆菌能产生过氧化氢酶和磷酸脂酶,氧化酶强阳性,无其他生化反应。 4.5.6 凡符合马生殖道泰勒氏杆菌一般特征和生化特性的细菌,可初步判定为马生殖道泰勒氏杆菌, 如初步判定为马生殖道泰勒氏杆菌,则需要进一步应用马生殖道泰勒氏杆菌特异抗血清进行血清学 鉴定。 5 病原血清学鉴定技术 5.1 玻片乳胶凝集试验 5.1.1 试验材料 5.1.1.1 马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原。 5.1.1.2 马生殖道泰勒氏杆菌阳性血清致敏乳胶。 5.1.1.3 马生殖道泰勒氏杆菌阴性血清致敏乳胶。 5.1.1.4 载玻片。 5.1.1.5 玻璃铅笔。 5.1.1.6 接种环。 5.1.1.7 牙签或火柴杆。 5.1.2 操作程序 使用前,马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原应充分振荡,所有试剂在室温平衡使其温度达到20℃ 左右。 取洁净载玻片一块,用玻璃铅笔划成小格。 滴加1滴马生殖道泰勒氏杆菌阳性血清致敏乳胶(约25μL),再用接种环在琼脂培养基上钩取待 鉴定细菌培养物适量,或滴加1滴液体培养物(约25μL)。 同时于载玻片另一端滴加1滴马生殖道泰勒氏杆菌阴性血清致敏乳胶,同样钩取该细菌培养物混 匀于其中。 以牙签或火柴杆混匀,在3min~5min内判定结果。 5.1.3 结果判定 “++++”:100%凝集,全部乳胶凝集,成絮状团块,出现大的凝集片或粒状物,液体清亮。 “+++”:75%凝集,大部分乳胶凝集成较小的颗粒,有可见凝集块,液体清亮,几乎完全透明。 “++”:50%凝集,半量乳胶凝集成细小颗粒,出现比较明显的颗粒状凝集颗粒或小凝块,液体不甚 透明。 “+”:25%凝集,仅可勉强看到粒状物,或较少量的乳胶凝集成可见的细颗粒,液体混浊。 “-”:无凝集现象,全部乳胶液体仍为均匀混浊,无颗粒。 以“++”或以上的反应强度作为该反应滴度的终点,判为凝集试验阳性。 5.1.4 结果说明 玻片乳胶凝集试验因可能出现非特异性凝集反应,仅用做马生殖道泰勒氏杆菌的初步血清学鉴定。 3GB/T27529—2011 5.2 间接荧光抗体法 5.2.1 试验材料 5.2.1.1 马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原。 5.2.1.2 马生殖道泰勒氏杆菌荧光标记的标准阳性血清。 5.2.1.3 马生殖道泰勒氏杆菌标准阴性血清。 5.2.1.4 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗抗体诊断液。 5.2.1.5 0.1mol/LpH8.0磷酸盐缓冲液(PBS)(见附录B)。 5.2.1.6 甘油缓冲液(见附录B)。 5.2.1.7 丙酮:乙醇(体积比1∶1,-20℃预冷)。 5.2.1.8 恒温培养箱。 5.2.1.9 荧光显微镜。 5.2.1.10 载玻片。 5.2.1.11 盖玻片。 5.2.1.12 玻璃铅笔。 5.2.1.13 接种环。 5.2.1.14 镊子。 5.2.1.15 染色缸。 5.2.2 操作程序 取一干净载玻片,用玻璃铅笔画定样品区域(直径0.5cm),用接种环在琼脂培养基上钩取待鉴定 细菌培养物适量,涂布均匀,风干。同时以马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原作为阳性对照。 待涂片似干未干时,滴加预冷丙酮:乙醇液,固定细胞5min~10m