ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27528—2011 口 蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法 Real-timeRT-PCRfordetectionoffootandmouthdiseasevirus 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录A、附录B为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、北京盈九思 科技发展有限公司。 本标准主要起草人:秦智锋、林祥梅、吴绍强、花群义、卢体康、刘建、陈书琨、吕建强、曾少灵、 詹爱军、韩雪清、孙洁、曹琛福、贾广乐、高小博、陈兵、阮周曦、梅琳、张彩虹、陶虹。 ⅠGB/T27528—2011 口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法 1 范围 本标准规定了口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于口蹄疫病毒的检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088 出入境动物检疫采样 GB/T18935 口蹄疫诊断技术 GB19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T1193 基因检验实验室技术要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 Ct值:循环阈值(cyclethreshold)。 4 试剂耗材和仪器设备 4.1 试剂耗材 4.1.1 除非另有说明,在检测中使用的试剂均为分析纯,实验室用水应符合GB/T6682的要求。 4.1.2 口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR试剂:-20℃保存,见附录A。 4.1.3 引物和探针序列 上游引物(FMDV-F)序列为:5′ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA3′。 下游引物(FMDV-R)序列为:5′GCGAGTCCTGCCACGGA3′。 TaqMan探针(FMDV-Pb)序列为:5′TCCTTTGCACGCCGTGGGAC3′,其5′端和3′端分别标记 FAM和BHQ。 4.1.4 DEPC处理水:见附录B。推荐购买商品化DEPC处理的无DNA酶和RNA酶的水。 4.1.5 氯仿:分析纯,常温保存。 4.1.6 异丙醇:分析纯,使用前预冷至-20℃。 4.1.7 75%乙醇:用DEPC水和无水乙醇配制,使用前预冷至-20℃。 4.1.8 石英砂:市售化学纯,121℃,15min高压灭菌后备用。 4.1.9 0.01mol/LPBS,pH7.6~7.8:见附录B。 4.1.10 阳性对照为灭活疫苗毒或组织培养灭活毒,-20℃保存备用。阴性对照样品可采用健康的猪 或牛的组织材料。 4.2 主要仪器设备 4.2.1 荧光PCR检测仪。 4.2.2 高速台式冷冻离心机:可控温至4℃,离心速度可达12000g以上。 1GB/T27528—2011 4.2.3 生物安全柜。 5 采样和样品前处理 5.1 样品采集、保存及运输 按照GB/T18088和GB/T18935的要求进行。 5.2 样品制备 5.2.1 样品的制备应符合GB19489规定。 5.2.2 用无菌的手术刀采取动物机体组织(如舌、鼻、蹄水泡皮)0.2g~1.0g置研钵中,加入等量灭菌 石英砂充分研磨。其他机体组织(如淋巴结、扁桃体、肌肉等)除去包膜和其他结缔组织,选取内部实质 部分,置研钵中,加入石英砂充分研磨。然后按照1∶5比例加入0.01mol/LPBS(pH7.6~7.8),4℃ 浸泡过夜或者-20℃反复冻融2次,每次30min。然后4℃8000g离心5min。 5.2.3 液体样品如水泡液或者食道咽部黏液(O-P液)不必经过研磨或者冻融处理,直接进行下一步。 6 核酸提取 6.1 核酸提取要求 核酸提取应按照SN/T1193进行。 6.2 传统酚氯仿法抽提核酸 6.2.1 取灭菌的1.5mL离心管,做好标识。 6.2.2 每管加入600μL裂解液,分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL,再加入200μL氯 仿,混匀器上振荡混匀5s,于4℃12000g离心15min。 6.2.3 取灭菌的1.5mL离心管,加入-20℃预冷400μL异丙醇,吸取本标准6.2各管中的上清液转 移至相应的管中,避免吸出中间层,颠倒混匀。 6.2.4 于4℃12000g离心15min,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体;加入600μL75%预冷乙醇, 颠倒洗涤。 6.2.5 于4℃12000g离心10min,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体。 6.2.6 10000g离心10s,用微量加样器将其吸干,室温干燥5min~10min 6.2.7 加入15μLDEPC水,溶解管底的RNA,5000g离心5s,冰上保存备用,若需长期保存应放置 -70℃冰箱。 6.3 核酸提取等效方法 口蹄疫病毒核酸提取也可以采用等效RNA提取试剂及方法:如采用自动化核酸抽提仪和配套核 酸抽提试剂进行核酸抽提。 7 实时荧光RT-PCR检测 7.1 反应液的配制 配制每个PCR反应混合液:实时荧光RT-PCR反应液14.5μL,Taq酶0.25μL,反转录酶 0.25μL。 将以上PCR反应试剂按使用量吸取到一个离心管中,充分混匀,然后在每个PCR管中分装15μL, 转移至样本处理区。 7.2 加样 在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸10μL,盖上管盖,将PCR管放 入荧光PCR检测仪内,记录样本放置顺序。 2GB/T27528—2011 7.3 PCR扩增检测 7.3.1 反应条件设定 第一步:42℃30min,95℃5min。 第二步:95℃10s,55℃1min,72℃30s,5个循环。 第三步:95℃5s,60℃30s,40个循环,60℃时设置采集荧光。 7.3.2 荧光素设定 ReportDye设定为FAM,QuenchDye都设定为BHQ,Referencedye设定为None。 8 结果判定 8.1 判定前的设置 综合分析仪器给出的各项结果,基线以仪器给出的默认值作为参考,阈值设定原则以阈值线刚好超 过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准,具体根据仪器噪声情况进行调整,选择FAM通道进行 分析。 8.2 试验成立判定 选用FAM通道进行分析,阳性对照样品有对数扩增曲线,而且Ct值≤30,阴性对照没有对数扩增 曲线,而且Ct值为无,二者均成立才可判定试验成立,否则试验无效。 8.3 阳性判定 Ct值≤30的样本为阳性,表明口蹄疫病毒核酸阳性。 8.4 阴性判定 Ct值显示为无的样本为阴性样本,表明口蹄疫病毒核酸阴性。 8.5 可疑判定 如果30<Ct值≤40,判为可疑。此时重复扩增检测,如果重复扩增曲线为对数扩增曲线且Ct≤ 40,判为样本阳性,表明口蹄疫病毒核酸阳性;否则判为样本阴性。 3GB/T27528—2011 附 录 A (规范性附录) 实时荧光RT-PCR反应液及裂解液组成 A.1 实时荧光RT-PCR反应液组成 实时荧光RT-PCR反应液(1×):含50mmol/LKCl,10mmol/LTris-HCl(pH8.3),2.5mmol/L MgCl2,0.2mmol/LdNTPmix,上、下游引物各200nmol/L,探针100nmol/L,1UTaq酶,100U逆转 录酶,2mmol/LDTT,5%甘油。 A.2 裂解液组成 裂解液主要成分为异硫氰酸胍和酚,为RNA提取试剂,于4℃保存。 4GB/T27528—2011 附 录 B (规范性附录) 溶液的配制 B.1 DEPC水 每升三蒸水中加入1mLDEPC,用力摇匀,使DEPC充分混匀在水中,37℃放置12h以上,再经 121℃15min高压灭菌备用。 B.2 0.01mol/LPBS(pH7.6~7.8) 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 3.0g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.2g 氯化钾(KCl) 0.2g 氯化钠(NaCl) 8g 加三蒸去离子水定容至1000mL,完全溶解后用3mol/L的NaOH调pH为7.6~7.8。经 121℃,15min高压灭菌,室温保存。 5GB/T27528—2011