ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27521—2011 猪 流感病毒核酸RT-PCR检测方法 RT-PCRassayforswineinfluenzavirusnucleicacid 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,中国检验检疫科学研究院,中国兽医药品监 察所。 本标准主要起草人:乔传玲、韩雪清、杨焕良、刘业兵、陈艳、吴绍强、陈化兰、林祥梅、辛晓光、朱中武、 王慧煜、刘建、李建、梅琳、王伊琴、徐彪、阮周曦、宁宜宝、薄清如、秦智锋、林志雄。 ⅠGB/T27521—2011 猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法 1 范围 本标准规定了猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法的技术要求。 本标准规定的RT-PCR检测方法适用于检测猪肺脏组织、鼻腔及气管分泌物和这些采集样品培养 物中的猪流感病毒核酸。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DEPC:焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate) dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate) EB:溴化乙锭(ethidiumbromide) M-MLVRT:莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶(moloneymurineleukemiavirusreversetran- scriptase) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RNAaseinhibitor:RNA酶抑制剂 RT-PCR:反转录-聚合酶链式反应(reverse-transcriptionpolymerasechainreaction) SPF:无特定病原体(specificpathogenfree) TaqDNApolymerase:TaqDNA聚合酶 3 仪器 3.1 PCR仪。 3.2 台式低温高速离心机。 3.3 电泳仪。 3.4 电泳槽。 3.5 冰箱。 3.6 凝胶成像系统。 3.7 微量移液器。 3.8 水浴锅。 4 试剂 4.1 LSTRIzolRNA提取试剂或其他商品化的RNA提取试剂。 4.2 氯仿、异丙醇、无水乙醇。 4.3 1.2%琼脂糖凝胶,见附录A中A.1。 4.4 50×TAE缓冲液,见附录A中A.2。 1GB/T27521—2011 4.5 溴化乙锭(EB,10μg/μL)或核酸染料,见附录A中A.3。 4.6 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水,见附录A中A.4。 4.7 DNA分子量标准(100bp)。 4.8 M-MLV反转录酶。 4.9 RNA酶抑制剂。 4.10 TaqDNA聚合酶。 4.11 dNTP。 4.12 商品化的一步法RT-PCR反应试剂。含有RT-PCR缓冲液,酶混合物,dNTP混合物,无RNA 酶的水等。 5 引物 5.1 反转录引物见附录B中B.1。引物浓度为20pmol/μL。 5.2 PCR引物见附录B中B.2。引物浓度均为20pmol/μL。 6 样品对照 以灭活的猪流感病毒感染SPF鸡胚尿囊液或者感染动物的组织作为阳性对照,以正常SPF鸡胚尿 囊液或者正常动物组织作为阴性对照。 7 操作步骤 7.1 样品的采集及处理 7.1.1 采样工具 下列采样工具应经121℃±2℃,15min高压灭菌并烘干: a) 棉拭子; b) 剪刀; c) 镊子; d) 1.5mL离心管; e) 研钵。 7.1.2 活猪 取鼻拭子。采集方法如下:将棉拭子深入鼻腔旋转,取鼻腔分泌液;将采样后的拭子分别放入盛有 1.0mLPBS(见附录A中A.5)的1.5mL离心管中,加盖、编号。 7.1.3 病死猪 取肺脏或气管分泌物等。采集方法如下:用无菌镊子和剪刀采集肺脏等,装入一次性塑料袋或其他 灭菌容器,编号。 7.1.4 样品贮运 样品采集后,放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋),于保温箱中加冰、密封,24h 内送实验室。 2GB/T27521—2011 7.1.5 样品处理 7.1.5.1 棉拭子处理方法 样品在混合器上充分混合后,用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出,弃去拭子,室温静置30min, 4℃、3000r/min离心15min,取上清液转入无菌的1.5mL离心管中,编号备用。 7.1.5.2 脏器处理方法 将所采组织病料置于洁净、灭菌并烘干的研磨器中,按质量体积比(1∶1)加入样品保存液进行充分 研磨;4℃、3000r/min离心15min,取上清液转入无菌的1.5mL离心管中,编号备用。 7.2 RNA的提取 7.2.1 用LSTRIzol试剂提取待检样品、阳性对照及阴性对照样品的RNA。 7.2.2 250μL样品处理液和750μLLSTRIzol置入一个1.5mL离心管,振荡数次,静置5min。 7.2.3 加200μL氯仿,振荡混匀,室温放置5min,4℃12000r/min,离心15min。 7.2.4 吸取上层水相至一新离心管中,加入等量异丙醇,混匀,室温放置15min,4℃、12000r/min离 心15min,离心后在离心管边和底部可见有胶样RNA沉淀(对于细胞毒而言,可能看不到沉淀)。弃 上清。 7.2.5 小心吸弃上清,加入500μL75%乙醇(DEPC水配置),小心颠倒以漂洗沉淀及管壁,4℃、 12000r/min,离心5min。 7.2.6 小心吸弃上清,沉淀置室温条件下干燥后,加适量DEPC水溶解。 7.2.7 提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增,若需长期保存,须放置-70℃冰箱保存。 7.2.8 也可采用商品化的基因组RNA提取试剂,按照说明书进行操作。同时进行阴、阳性对照样品 RNA的提取。 7.3 RT-PCR 7.3.1 一步法反应操作步骤(如实验室有商品化的一步法RT-PCR反应试剂采用此操作步骤) 7.3.1.1 在0.2mL反应管中依次加入: 一步法RT-PCR缓冲液 10μL dNTP(10mmol/L) 2.0μL 酶混合物 2.0μL RNA酶抑制剂 0.5μL 上游引物 0.5mL 下游引物 0.5μL RNA模板 5μL DEPC水 29.5μL 上述体系根据扩增目的片段不同,分别选择相应的M、H1HA、甲H1HA、H3HA、N1NA及N2NA 单个基因的上/下游引物进行反应。 7.3.1.2 采用PCR仪立即进行RT-PCR扩增。检测同时设立阴、阳性对照。 7.3.1.3 RT-PCR反应条件为:48℃45min;94℃2min;然后94℃30s,50℃1min,68℃2min, 共40个循环;最后68℃延伸7min。 7.3.2 两步法反应操作步骤(如实验室没有商品化的一步法RT-PCR反应试剂采用此操作步骤) 7.3.2.1 RT取5μLRNA,加1μL反转录引物(Uni12),70℃水浴5min。 3GB/T27521—2011 7.3.2.2 冰浴2min,继续加入: 5×反转录反应缓冲液 4μL 0.1mol/LDTT 2μL 2.5mmol/LdNTPs 2μL M-MLV反转录酶 0.5μL RNA酶抑制剂 0.5μL DEPC水 5μL 7.3.2.3 37℃水浴1h,合成cDNA。取出直接进行PCR或置-20℃保存。 7.3.2.4 根据扩增目的片段不同,选择相应的上/下游引物进行扩增。 PCR体系包括: 双蒸灭菌水 37.5μL 反转录产物 4μL 上游引物 0.5μL 下游引物 0.5μL 10×PCRBuffer 5μL 2.5mmol/LdNTPs 2μL Taq酶 0.5μL 首先加入双蒸灭菌水,然后再按照顺序逐一加入上述成分,每一次要加入到液面下。全部加完后, 混匀,瞬时离心,使液体都沉降到PCR管底。 7.3.2.5 PCR反应条件为:95℃预变性5min;94℃变性45s,50℃退火45s,72℃延伸45s,循环 30次;72℃延伸6min。 8 扩增产物的电泳检测 制备1.2%琼脂糖凝胶板,见附录A中A.1。在电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液,使液面刚刚没 过凝胶。取3μL~5μL扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后,加到凝胶孔。加入分子量标准。恒压 (110V)下电泳30min~40min,将电泳好的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。 9 试验成立的条件 阳性对照的扩增产物经电泳检测,在预期大小的条带位置均出现特异性条带,阴性对照的扩增产物 经电泳检测均没有预期大小的目的条带。阴、阳性对照同时成立则表明试验有效,否则试验无效。 10 结果判定 10.1 阳性判定 应用引物M-684U/M-684L、H1-668U/H1-668L、甲-428U/甲-428L、H3-668U/H3-668L、 N1-615U/N1-615L、N2-246U/N2-246L,按照各基因检测体系对样品进行检测,扩增产物如果在 684bp、668bp、428bp、668bp、615bp、246bp位置出现特异性条带,则判定为猪流感病毒或相应亚型 病毒核酸阳性。 10.2 阴性判定 如果在所用引物预期扩增片段的位置均未出现特异性条带,则判定为猪流感病毒核酸阴性。 4GB/T27521—2011 附 录 A (规范性附录) 相关试剂