ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T27518—2011 西 尼罗病毒病检测方法 Diagnosticofwestnilevirusinfections 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局、北京百欧赛地生物工程技术开发中心。 本标准主要起草人:杨秀娟、孙福军、丁若愚、田茵、田睿、王飞、杨静。 ⅠGB/T27518—2011 西尼罗病毒病检测方法 1 范围 本标准规定了西尼罗病毒的反转录聚合酶链反应(ReverseTranscription—PolymeraseChainRe- action,RT-PCR)、蚀斑减少中和试验(PlaqueReductionNeutralizationTest,PRNT)和西尼罗病毒的 分离方法。 本标准适用于易感动物的西尼罗病毒病的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ABTSdiammonium2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate):2,2′-连氮基-双-(3-乙基苯 并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐 AMV:鸟类成髓细胞白血病病毒(avianmyeloblastosisvirus) BSA:牛血清白蛋白(bovineserumalbumin) CPE:细胞病变效应(cytopathiceffect) cDNA:互补DNA(complementaryDNA) DEPC:焦碳酸乙二酯(diethylpyrocarbonate) DNAdeoxyribonucleicacid:脱氧核糖核酸 dH2O:双蒸水(doubledistilledwater) dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)含有dCTP、dGTP、dATP、dTTP四 种脱氧核糖核苷 EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) 6-FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein) HEPES:羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonicacid) MEM:基础培养基(minimaessentialmedium) OligodT:多聚T再加上一小段随机碱基(几个碱基)构成的引物,用于RT-PCR PBS:磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebelancedsolution) PFU:蚀斑形成单位(plaqueformingunits) PRNT:蚀斑减少中和试验(plaquereductionneutralizationtest) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RNasin:核酸酶抑制剂(RNAenzymeinhibitor) TAE:醋酸盐EDTA(tris-acetate-EDTATris) 1GB/T27518—2011 Taq酶:耐热DNA聚合酶(thermusaquaticuspolymerase) TAMRA:四甲基罗丹明(carboxytetramethylrhodamine) TRIzol:一种新型总RNA抽提试剂(trizolreagent),可以直接从细胞或组织中提取总RNA Vero细胞:非洲绿猴肾细胞 WNV:西尼罗病毒(westnilevirus) 4 试剂 4.1 水:符合GB/T6682中一级水的规格,用DEPC处理以除掉RNA酶。 4.2 TRIzol试剂或其他等效的商品化RNA抽提试剂。 4.3 AMV逆转录酶:20U/uL,-20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.4 5×AMVBuffer:AMV逆转录酶的缓冲液。 4.5 RNasin:20U/uL,-20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.6 Oligo(dT):RT-PCR的引物。 4.7 10×TaqBuffer:Taq酶的缓冲液。 4.8 Taq酶:-20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.9 dNTP三磷酸脱氧核糖核苷,含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmoL/L。 4.10 琼脂糖:电泳级。 4.11 三氯甲烷:分析纯。 4.12 异丙醇:分析纯,使用前预冷到-20℃。 4.13 75%乙醇。 4.14 PBS:121℃高压15min后,无菌加入青霉素和链霉素至1000U/mL。 4.15 TAE:24.2gTris碱、5.7lg冻乙酸、0.5mol/LEDTA(pH8.0)10mL,加水定容至100mL,使 用前作50倍稀释,用盐酸调节pH值至7.5~7.8。 4.16 WNV标准毒株、WNV阳性对照与WNV阴性对照。 4.17 MEM细胞培养基。 4.18 Vero细胞。 4.19 胎牛血清。 4.20 细胞维持液:含2%~3%胎牛血清、青霉素和链霉素分别为100U/mL的无菌MEM。 4.21 中性红水溶液:中性红粉0.1g,用去离子水定容至100mL,pH7.4,高压除菌或0.22μm滤膜过 滤,无菌分装于褐色瓶内,4℃保存备用。 4.22 2倍浓度不含中性红MEM液:10倍浓度不含酚红的MEM20mL,胎牛血清4mL,青霉素和链 霉素各10000U(μg),去离水定容至100mL,0.22μm滤膜过滤,pH7.2~7.4,4℃保存备用。 4.23 不含中性红的营养琼脂:使用前配制20g/L琼脂糖水浴融化后保持在43℃~45℃,加入等量 已加温至43℃~45℃的2倍浓度不含中性红MEM液,充分混合均匀,保存在43℃~45℃水浴中 备用。 4.24 2倍浓度含中性红MEM液:10倍浓度不含酚红的MEM20mL,胎牛血清4mL,青霉素和链霉 素各10000U(μg),中性红水溶液6mL,去离子水定容至100mL,0.22μm滤膜过滤,pH7.2~7.4, 4℃保存备用。 4.25 含中性红的营养琼脂:使用前配制20g/L琼脂糖水浴融化后保持在43℃~45℃,加入等量已 加温至43℃~45℃的2倍浓度含中性红MEM液,充分混合均匀,保存在43℃~45℃水浴中备用。 4.26 0.1%过氧化氢。 4.27 BSA:一般是在购置PCR试剂中带的,是在反应时保持酶活性的。不是必须的。不用自己配置。 2GB/T27518—2011 也可不加入反应中。 4.28 0.5mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液:碳酸钠0.32g,碳酸氢钠0.586g,加水溶解,定容至 200mL。 4.29 抗马IgM。 4.30 5%脱脂奶粉:5g的脱脂奶粉溶于100mL的PBS缓冲液中。 4.31 0.05%tween-20:吐温-20。 4.32 辣根过氧化物酶结合的抗黄病毒单克隆抗体。 4.33 Rnase:RNA酶(RNApolymerase)。 5 器材和设备 5.1 24孔细胞培养板。 5.2 96孔细胞培养板。 5.3 二氧化碳培养箱。 5.4 普通冰箱和超低温冰箱:规格2℃~8℃,-20℃,-80℃。 5.5 研磨器/研钵。 5.6 离心机(规格≥15000g)。 5.7 荧光RT-PCR检测仪。 5.8 PCR仪。 5.9 可调移液器。 5.10 电泳仪。 5.11 细胞瓶。 5.12 微型滤器:装有0.22μm滤膜,121℃高压15min。 5.13 5%脱脂乳封板。 6 WNV的分离 6.1 实验室生物安全要求 实验室生物安全要求按照附录A执行。 6.2 样本采集 疑似死于西尼罗病毒病的动物可考虑采集血液、血清、脑脊液或组织,其中组织样品可优先采取脑 组织和神经组织,其次可采集肾、脾和肝组织。 进行血样采集时避免使用阻碍PCR反应的肝素,可用抗凝剂EDTA采血。 6.3 样本运输与储存 血清样本应冷藏,24h内运送至实验室(血清标本可在4℃存放1周,长期保存置-20℃或以下)。 其他样本送至实验室后,病毒分离样本应尽快进行接种分离,48h内进行接种的可置于4℃保存,如未 能接种应置-70℃或以下保存,避免反复冻融。 6.4 样本处理 取感染样本送专业实验室检测,样本的储存和运输应保持在低于-70℃中。 组织样本取1g~2g在无菌研磨器或研钵中,加5mL~10mL含10%胎牛血清的PBS溶液,磨 3GB/T27518—2011 碎,冻融2次~3次,3000g离心10min,上清液用微型滤器过滤后备用。 血液样本直接冻融2次~3次,用含10%胎牛血清的PBS溶液稀释10倍,3000g离心10min,上 清液用微型滤器过滤后备用。 脑脊液样本用含10%胎牛血清的PBS溶液稀释5倍~10倍,3000g离心10min,上清液用微型滤 器过滤后备用。 6.5 病毒分离 处理好的样本悬液接种至已80%~90%满度单层Vero细胞,24孔细胞培养板每孔加0.2mL~ 0.3mL,100mL细胞瓶每瓶加1mL~2mL,5%二氧化碳培养箱中37℃吸附1h~2h,倾去病理材料 悬液,加入细胞维持液,5%二氧化碳培养箱中37℃吸附3d~5d