ICS11.020 C05 中华人民共和国国家标准 GB/T26350—2010 蝇 类抗药性检测方法 家蝇生物测定法 Testmethodsofflyresistancetoinsecticides— Thebioassaymethodsformuscadomestica 2011-01-14发布 2011-05-01实施 中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位:中国农业大学、北京市疾病预防控制中心、中国人民解放军军事医学科学院微生 物流行病研究所。 本标准主要起草人:高希武、曾晓芃、马彦、刘婷、梁沛、钱坤、赵彤言。 ⅠGB/T26350—2010 蝇类抗药性检测方法 家蝇生物测定法 1 范围 本标准规定了家蝇(Muscadomestica)对有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等杀虫药剂抗药性的生 物检测方法。 本标准适用于家蝇抗药性的实验室生物检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 诊断剂量 diagnosticdose 由敏感品系的敏感基线计算得到的与死亡率99%或99.9%相对应的杀虫药剂剂量值,该剂量值能 使敏感品系99%或99.9%的个体致死,利用该剂量通过生物测定技术区分抗性和敏感个体。 2.2 F1代 F1generation 从现场捕捉的家蝇,繁殖后得到的第一代。 2.3 点滴法 topicalapplicationmethod 将一定量的药液直接滴在昆虫体壁的特定部位以测定药剂对供试昆虫的触杀毒力。 2.4 药膜法 medicalmembranemethod 将一定量的药液施布于载体的表面并形成均匀的药膜,然后将试虫放于载体上,药剂通过昆虫的 足、体壁等进入虫体内起到毒杀作用,间隔一定时间后统计死亡率。常见的载体有滤纸、玻璃表面等。 3 试虫 现场采集家蝇,室内饲养,羽化后3d~5d的F1代雌性家蝇。 4 试剂 丙酮或其他有机溶剂、CO2或乙醚、杀虫药剂原药。 5 仪器 具可控光照和温度的培养箱或房间,养虫笼,100mL血清瓶,移液管,微量点滴器(微量进样器)。 1GB/T26350—2010 6 测试条件 温度:25℃±1℃,光周期:14L:10D,相对湿度:60%~80%。 7 敏感基线法 7.1 原理 依据杀虫剂应用剂量和害虫死亡机率值关系建立毒力回归方程,以敏感品系得到的杀虫剂毒力回 归线作为为敏感基线。以待测昆虫种群得到的杀虫剂毒力回归线与敏感基线对比,来确定待测种群的 抗性水平。具体是比较两条毒力回归线的b值变化以及由毒力回归线计算得到的半数致死量的变化。 7.2 操作步骤 7.2.1 药膜法 用丙酮或其他易挥发的有机溶剂将杀虫药剂母液稀释到一系列的浓度(通过预实验确定药剂的浓 度系列范围,最低浓度时死亡率小于20%,最高浓度时大于80%),然后取0.5mL溶液加入100mL血 清瓶中,不断转动血清瓶,使药液均匀分布于瓶内壁,置于通风橱中过夜,使有机溶剂挥发完全。然后每 瓶放试虫20只,用纱网或纱布封口。实验重复5次。以相应溶剂处理为对照组。3h后统计死亡率。 根据每一浓度对应的死亡率求出回归方程,根据回归方程可以求出LC50值。需要分别测定并求出实验 室敏感种群和待测种群的LC50值。 7.2.2 点滴法 用丙酮或其他易挥发的有机溶剂将杀虫药剂母液稀释到一系列的浓度(通过预实验确定药剂的浓 度系列范围,最低浓度时死亡率小于20%,最高浓度时大于80%),将试虫用乙醚或CO2等麻醉至昏 迷。用微量点滴器将0.5μL~1μL杀虫药剂溶液点滴在雌性家蝇前胸背板上。每个处理点滴30只羽 化后3d~5d雌性家蝇,以相应溶剂点滴为空白对照,实验重复3次。将受药后的试虫转入清洁容器 内,供给水和食物,正常饲养,24h后统计死亡率。根据每一浓度对应的死亡率求出回归方程,根据回 归方程可以求出LD50值。需要分别测定并求出实验室敏感种群和待测种群的LD50值。 7.3 死亡判断 试虫完全不动或腹部上翻、抽搐,不能爬行视为死亡。 7.4 结果表述 结果用抗性倍数表述,抗性倍数=待测种群LC50(LD50)值/敏感种群LC50(LD50)值。 7.5 判别标准 敏感品系和测定样本95%置信限不重叠,且抗性倍数≥5倍为抗性种群。 8 诊断剂量法 8.1 原理 依据药剂对敏感品系的毒力回归线,确定一个能够区分敏感个体和抗性个体或抗性杂合子的剂量。 2GB/T26350—2010 一般用敏感品系的LD99(LC99)值作为诊断剂量,预期死亡率为99%。 8.2 操作步骤 8.2.1 药膜法 用丙酮或其他的有机溶剂将供试杀虫药剂配成一定浓度的母液。用丙酮或其他易挥发的有机溶剂 将杀虫药剂稀释到一定的浓度,取0.5mL溶液加入100mL血清瓶中(血清瓶内表面药膜的最终剂量 达到诊断剂量,常见杀虫药剂对敏感家蝇种群的诊断剂量参见表A.1),不断转动血清瓶,使药液均匀 分布于瓶内壁,置于通风橱中过夜,使有机溶剂挥发完全。然后每瓶放试虫20只,用纱网或纱布封口。 实验重复5次。以相应溶剂处理为对照组。在测试条件下放置3h后,检查结果并计算死亡率。 8.2.2 点滴法 用丙酮或其他易挥发的有机溶剂将杀虫药剂母液稀释到诊断剂量需要的浓度。将试虫用乙醚、 CO2等麻醉至昏迷。用微量点滴器将0.5μL~1μL杀虫药剂溶液点滴在雌性家蝇胸部背板上(每头 家蝇的受药量等于诊断剂量,常见杀虫药剂对敏感家蝇种群的诊断剂量见表A.1)。每个处理点滴 30只羽化后3d~5d雌性家蝇,以相应溶剂点滴为空白对照,实验重复3次。将受药后的试虫转入清 洁容器内,供给水和食物,正常饲养,24h后统计死亡率。 8.3 死亡判断 试虫完全不动或腹部上翻、抽搐,不能爬行视为死亡。 8.4 结果表述 结果用死亡率表述,计算见公式(1)。 M=Nm N×100% ……………………(1) 式中: M ———死亡率; Nm———死亡虫数; N———试虫总数。 对照死亡率小于5%无需校正;对照死亡率在5%~20%之间,用Abbott公式进行校正;对照死亡 率大于20%为无效测定。 依据Abbott公式校正死亡率,计算见公式(2)。 Mm=Mt-Mc 1-Mc×100% ……………………(2) 式中: Mm———校正死亡率; Mt———处理组死亡率; Mc———对照组死亡率。 8.5 判别标准 校正死亡率小于80%为抗性种群。GB/T26350—2010 GB/T26350—2010 附 录 A (资料性附录) 常见杀虫药剂对敏感家蝇种群的诊断剂量 表A.1给出了常见杀虫药剂对敏感家蝇种群的诊断剂量。 表A.1 常见杀虫药剂对敏感家蝇种群的诊断剂量 杀虫药剂诊断剂量(药膜法) LD99 μg/cm2诊断剂量(点滴法) LD99 μg/只 残杀威(propoxur) 0.30 1.0 敌敌畏(DDVP) 2.00 1.0 胺菊酯(tetramethrin) 1.00 0.30 溴氰菊酯(deltamethrin) 0.03 0.005 高效氯氰菊酯(alpha-cypermethrin) 0.04 0.025 注:敏感品系来自中国农业大学选育的家蝇敏感品系,2004年测定结果。 0102—05362T / BG