ICS11.020 C05 中华人民共和国国家标准 GB/T26348—2010 蚊 虫抗药性检测方法 不敏感乙酰胆碱酯酶法 Testmethodsofmosquitoresistancetoinsecticides— Testmethodsofinsensitiveacetylcholinesteraseforthemosquito 2011-01-14发布 2011-05-01实施 中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所、中国农业大学、北京市疾 病预防控制中心。 本标准主要起草人:赵彤言、汪中明、李春晓、董言德、高希武、曾晓芃、佟颖。 ⅠGB/T26348—2010 蚊虫抗药性检测方法 不敏感乙酰胆碱酯酶法 1 范围 本标准规定了蚊虫体内不敏感的乙酰胆碱酯酶(AChE)的检测方法。 本标准适用于淡色库蚊(Culexpipienspallens)、致倦库蚊(Cx.pipiensquinquefasciatus)、白纹伊 蚊(Aedesalbopictus)、中华按蚊(Anophelessinensis)等对有机磷类、氨基甲酸酯类杀虫剂抗性的生物 化学检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 乙酰胆碱酯酶区分浓度 discriminatingconcentrationofacetylcholinesterase 能够抑制敏感蚊虫乙酰胆碱酯酶生理活性90%的杀虫药剂的浓度。 3 试虫 现场多点采集幼虫,室内饲养,采用羽化后3d~5d未吸血雌蚊进行检测,冰浴条件下储存不超过 1d,-20℃条件下储存不超过1周或-80℃条件下储存6个月以内。 4 试剂 4.1 磷酸氢二钠(Na2HPO4),分析纯。 4.2 磷酸二氢钾(KH2PO4),分析纯。 4.3 曲拉通X-100(TritonX-100)。 4.4 乙酰硫代胆碱(ATCh),分析纯。 4.5 5,5’-二硫双硝基苯甲酸(DTNB),分析纯。 4.6 磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.5PBS):称取30.18gNa2HPO4·12H2O和2.16gKH2PO4,蒸馏 水定容至1000mL。 4.7 DTNB-乙醇显色剂:12.4mgDTNB,加120mL95%乙醇,80mL蒸馏水,50mL磷酸盐缓冲液 (pH7.5,0.1mol/L,含0.1%TritonX-100)。 4.8 ATCh溶液:称取28.9mgATCh溶于10mL蒸馏水中,-20℃避光保存。 4.9 ATCh-DTNB混合溶液:称取75mgATCh和13mgDTNB,用100mL磷酸盐缓冲液溶解。 5 分光光度法 5.1 仪器设备 5.1.1 分光光度计。 1GB/T26348—2010 5.1.2 恒温水浴箱。 5.1.3 1mL玻璃组织匀浆器。 5.1.4 离心机(离心力10000g以上)。 5.1.5 加液器。 5.2 操作步骤 5.2.1 酶源的制备 取成蚊5只做为1组,放入4℃预冷的玻璃组织匀浆器中,加入0.5mL磷酸盐 缓冲液(pH7.5,0.1mol/L,含0.1%TritonX-100),充分匀浆。匀浆液在4℃,5000g离心5min,取 上清液作为待测酶液,冰浴保存备用。 5.2.2 取6支试管,分别加入6.1.1中制备酶液0.1mL,在其中3支试管中分别加入0.1mL的杀虫 剂溶液,充分混匀,使其终浓度达到区分浓度(常用杀虫剂对淡色库蚊乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附 录A表A.1),且丙酮终浓度小于1%。另3支试管中加入0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管; 再取1支试管加入0.2mL磷酸盐缓冲液,作为空白对照。 5.2.3 上述7支试管30℃保温5min后,分别加入0.1mL0.01mol/L乙酰硫代胆碱(ATCh),在 30℃继续保温15min后,加入3.6mLDTNB-乙醇显色剂。 5.2.4 将空白对照调至仪器显示为0点,在分光光度计中于412nm波长下测定无药剂对照管和药剂 处理管的光密度值(OD412),计算平均值。 5.2.5 按上述方法每个种群检测100组蚊虫。 5.3 结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式(1): E=ODt ODc×100% ……………………………(1) 式中: E ———AChE残存活性; ODt———药剂处理管平均光密度值OD412; ODc———无药剂对照管平均光密度值OD412。 5.4 判别标准 AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE,具有不敏感AChE的蚊虫组为对有机磷或氨基甲酸 酯类药剂抗性组,抗性组在检测种群中的比例达到10%时为抗性种群。 6 酶标仪法 6.1 仪器设备 6.1.1 酶标仪。 6.1.2 恒温水浴箱。 6.1.3 1mL玻璃组织匀浆器。 6.1.4 离心机(离心力10000g以上)。 6.1.5 加液器。 2GB/T26348—2010 6.2 操作步骤 6.2.1 酶源的制备 取成蚊1只,放入4℃预冷的玻璃组织匀浆器中,加入0.5mL4℃预冷的磷酸盐 缓冲液充分匀浆。匀浆液在4℃,5000g离心5min,取上清液作为待测酶液,冰浴保存备用。 6.2.2 分取0.1mL6.2.1中制备酶液到酶标板的3个孔中,再在各孔中加入0.1mL杀虫剂溶液,杀 虫剂用磷酸缓冲液稀释,使其终浓度达到区分浓度(常用杀虫剂对淡色库蚊乙酰胆碱酯酶的区分浓度参 见表A.1),且丙酮的终浓度不超过1%。以0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照,加入另外3个孔 中。在30℃保温5min后,分别加入0.2mLATCh-DTNB混合溶液,在412nm测定5min时间动力 学曲线,曲线的斜率作为反应初速度(v)。计算平均值。 6.2.3 按上述方法每个种群检测100只蚊虫。 6.3 结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式(2): E=vt vc×100% ………………………(2) 式中: E———AChE残存活性; vt———药剂处理组平均反应初速度; vc———无药剂对照组平均反应初速度。 6.4 判别标准 AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE,具有不敏感AChE的蚊虫为对有机磷或氨基甲酸酯 类药剂抗性个体,抗性个体在检测种群中的比例达到10%时为抗性种群。GB/T26348—2010 GB/T26348—2010 附 录 A (资料性附录) 常用杀虫剂对淡色库蚊乙酰胆碱酯酶的区分浓度 表A.1给出了残杀威和敌敌畏对淡色库蚊乙酰胆碱酯酶的区分浓度。 表A.1 常用杀虫剂对淡色库蚊乙酰胆碱酯酶的区分浓度 杀虫剂区分浓度 g/L 残杀威(propoxur) 敌敌畏(DDVP)0.0115 0.0813 注:敏感品系来自军事医学科学院微生物流行病研究所蚊虫养殖室淡色库蚊北京株。 0102 — 84362T / BG