ICS65.020.30 B43 中华人民共和国国家标准 GB/T25887—2010 奶 牛脊椎畸形综合征检测 PCR-RFLP法 MethodofPCR-RFLPfordetectingcomplexvertebralmalformationindairycattle 2011-01-10发布 2011-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录B为规范性附录,附录A、附录C为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:华中农业大学。 本标准主要起草人:张淑君、杨利国、李翔、胡修忠、刘文举、宋利军。 ⅠGB/T25887—2010 奶牛脊椎畸形综合征检测 PCR-RFLP法 1 范围 本标准规定了奶牛脊椎畸形综合征的PCR-RFLP检测技术。 本标准适用于奶牛脊椎畸形综合征的检测与诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 奶牛脊椎畸形综合征 complexvertebralmalformationindairycattle;CVM 奶牛的一种常染色体隐性遗传病,主要表现为母牛流产、胎儿早期死亡、出生后不久死亡,患病犊牛 主要症状表现为:颈短、脊椎畸形、心脏畸形、腿部畸形、系部呈现对称的内向僵直等。 3.2 SLC35A3基因 SLC35A3gene 定位于牛第3号染色体上,在基因序列数据库(GenBank)中的登录号为AY160683,全长14901bp, mRNA为981bp,由7个外显子和6个内含子组成,该基因编码核糖转运蛋白,与脊柱发育有关,是奶牛 脊椎畸形综合征的致病基因。 3.3 限制性片段长度多态性 restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP 检测DNA用限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变 异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点)和一段DNA的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间 的长度发生变化)等均可导致RFLP的产生。 4 原理 SLC35A3基因第四外显子中第559位碱基由G突变为T时,其对应编码的氨基酸由缬氨酸改变 为苯丙氨酸,导致奶牛脊椎畸形综合征的发生。采用PCR-RFLP技术检测牛样本基因组DNA变异,即 采用PCR技术扩增SLC35A3基因片段,限制性内切酶消化PCR扩增产物,电泳检测酶切产物,对 SLC35A3基因进行分型,根据基因型判定奶牛是否携带脊椎畸形综合征的致病基因。 5 扩增SLC35A3基因片段的引入酶切位点PCR引物 5′CCACTGGAAAAACATGCTGTGAGTA3′ 5′GCTCTCCTCTGTAATCCCCA3′ 预期扩增长度为225bp。 1GB/T25887—2010 6 试剂和仪器 6.1 主要试剂 水应符合GB/T6682的灭菌双蒸水。 TaqDNA聚合酶及PCR缓冲液、RsaⅠ限制内切酶及10×酶切缓冲液、蛋白酶K、DNA分子质量 标记购自试剂公司。 TE缓冲液、TAE缓冲液、TBE缓冲液、PBS缓冲液、加样缓冲液、10%过硫酸铵、30%丙烯酰胺、 10%聚丙烯酰胺、溴化乙锭、10%SDS、1mol/LTris-HCl、0.5mol/LEDTA(pH8.0)、三氯甲烷/异戊 醇(24∶1)、3mol/L乙酸钠、固定液、脱色液、染色液、显影液、停显液等。具体配制方法参见附录A。 6.2 主要仪器 冷冻离心机、核酸蛋白浓度测定仪、梯度PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、电子天平、恒温水 浴锅、双蒸馏水器、微量移液器。 7 检测步骤 7.1 牛基因组DNA制备 采用常规的酚仿抽提法提取牛样本基因组DNA。4℃冰箱中保存备用。 7.2 PCR扩增及其产物检测 20μLPCR反应体系:0.4μmol/L引物、0.2mmol/LdNTP、待测DNA85ng~100ng、1UTaq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液,加适量双蒸水。可根据需要调整反应体系。 PCR反应条件:94℃变性3min,35个循环(94℃30s,65℃30s,72℃30s),72℃延伸10min, 4℃保温2min~10min。 取2μLPCR产物,2%~3%琼脂糖凝胶电泳(3V/cm~5V/cm,电泳20min~30min),溴化乙锭 (EB)染色后,在凝胶成像系统观察条带。PCR扩增结果示意图见附录B中的图B.1。 7.3 酶切及其产物检测 取16μLPCR扩增产物,加入5U限制内切酶RsaⅠ和2μL10×酶切缓冲液,加水至20μL,反应 条件参见产品说明书。 10%~12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(3V/cm~5V/cm,电泳3h~4h),银染(染色方法参见附录C)。 酶切图谱见附录B中的图B.2。 7.4 结果判定 由于24bp的条带太小,以致在10%~12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时显示不出来,但可根据 225bp、201bp条带进行样本基因型判定。 健康奶牛:基因型为GG型,即出现201bp一条电泳带; 隐性携带者:基因型为GT型,即出现225bp、201bp两条电泳带; CVM患者:基因型为TT型,即出现225bp一条电泳带。 2GB/T25887—2010 附 录 A (资料性附录) 主要试剂及配制方法 表A.1 主要试剂及配制方法 试 剂 配 制 方 法 TE缓冲液 10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0) 50×TAE缓冲液242gTris碱,57mL冰乙酸,100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),加双蒸水定容至 1000mL,使用时50倍稀释 10%过硫酸铵 称取1g过硫酸铵溶于8mL双蒸水,定容至10mL 5×TBE缓冲液54.0gTris碱,27.5g硼酸,20mL0.5mmol/LEDTA(pH8.0),加双蒸水定容至 1000mL,使用时5倍稀释 30%丙烯酰胺(丙烯酰胺:甲叉 双丙烯酰胺=29∶1)300mL双蒸水中溶解145g丙烯酰胺,5g甲叉双丙烯酰胺,用双蒸水定容至 500mL 10%聚丙烯酰胺量取9.3mL30%丙烯酰胺,18.5mL双蒸水,7mL5×TBE,0.23mL10%过硫酸 铵,0.02mLTEMED 加样缓冲液 0.25%溴酚蓝(质量浓度),40%蔗糖(质量浓度) 溴化乙锭(EB)100mL双蒸水中加入0.1gEB(10mg/mL),搅拌使完全溶解,转入棕色试剂瓶, 锡箔包裹 PBS缓冲液氯化钠8g,磷酸氢二钠1.44g,氯化钾0.2g,磷酸二氢钾0.24g加双蒸水定容至 1000mL,调pH值至7.0,高压灭菌,室温保存 10%SDS 称取50gSDS加热溶于400mL双蒸水中,定容至500mL,高压灭菌,室温保存 1mol/LTris-HCl称取121.4gTris碱溶于800mL双蒸水中,加浓盐酸调至pH8.0,定容到1000mL, 高压灭菌,室温保存 0.5mol/LEDTA(pH8.0)称取186.1g二水乙二胺四乙酸二钠溶于800mL双蒸水中,加入氢氧化钠(约 20g)调至pH8.0,定容到1000mL,高压灭菌,室温保存 三氯甲烷/异戊醇(24∶1) 量取480mL三氯甲烷,加入20mL异戊醇,混匀 3mol/L乙酸钠称取408.1g三水乙酸钠溶于800mL双蒸水中,用乙酸调至pH5.2,加水定容至 1000mL,高压灭菌,室温保存 固定液 450mL双蒸水中加入50mL乙醇 脱色液 492.5mL双蒸水中加入7.5mL浓硝酸 染色液 500mL双蒸水中溶解1g硝酸银,置棕色瓶中保存 显影液500mL双蒸水中溶解15g无水碳酸钠,加入1.32mL甲醛(0.046%),用双蒸水定 容至1000mL 停显液 485mL双蒸水中加入15mL冰乙酸 3GB/T25887—2010 附 录 B (规范性附录) SLC35A3基因PCR扩增产物及酶切产物电泳示意图 M为DNA分子质量标记; 泳道1~5分别为5个样本的PCR扩增产物(225bp)。 图B.1 SLC35A3基因PCR扩增产物电泳示意图 M为DNA分子质量标记; 泳道1~3、6、9、10为健康牛群基因型(GG型); 泳道4~5、7和8为隐性携带者牛群基因型(GT型)。 图B.2 SLC35A3基因PCR-RFLP酶切产物电泳示意图 4GB/T25887—2010 附 录 C (资料性附录) 凝胶染色方法 C.1 电泳完毕,取下玻璃板,小心地将凝胶从玻璃板上剥离下来,放入双蒸水中漂洗一次,然后浸入 10%乙醇溶液固定5min~10min。 C.2 用1%硝酸脱色3min~8min,然后双蒸水迅速漂洗一次。 C.3 0.2%硝酸银晃动闭光染胶15min~25min;染色结束后用双蒸水快速冲洗凝胶两次(每次10s), 洗去凝胶表面残留的硝酸银溶液。 C.4 在染胶盒中倒入含3%碳酸钠和微量甲醛的显色液,立即快速地晃动胶盒,避免析出的黑色银颗 粒在凝胶表面沉积。显色液颜色变暗时立即更换新鲜的显色液。 C.5 注意观察显色情况,目的条带显现清晰后立刻将凝胶转入3%的乙酸溶液,浸泡10min停显。 5GB/T2588