ICS65.020.30 B43 中华人民共和国国家标准 GB/T25876—2010 牛 早期胚胎性别的鉴定 巢式PCR法 MethodofnestedPCRforsexidentificationofearlycattleembryo 2011-01-10发布 2011-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录B为规范性附录,附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:华中农业大学。 本标准主要起草人:张淑君、杨利国、李翔、刘辉、刘文举、胡修忠。 ⅠGB/T25876—2010 牛早期胚胎性别的鉴定 巢式PCR法 1 范围 本标准规定了牛早期胚胎性别鉴定的巢式PCR方法。 本标准适用于奶牛和肉牛胚胎或胎儿的性别鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 巢式PCR nestedpolymerasechainreaction 利用两套PCR引物(巢式PCR引物对)进行两轮PCR扩增反应,在第一轮扩增中,外引物用以产 生扩增产物,此产物在内引物的存在下,作为DNA模板,进行第二轮扩增。 3.2 SRY基因 SRYgene 哺乳动物Y染色体上决定雄性性别的基因。 3.3 HBB基因 HBBgene β珠蛋白基因,位于常染色体上。 4 原理 利用巢式PCR反应的敏感性高和特异性强的特性,对少量胚胎细胞的SRY基因片段进行扩增,以 HBB基因的扩增作为阳性参照,电泳检测PCR扩增产物,根据扩增产物电泳条带鉴定胚胎性别。 5 引物 SRY1 5′CTACTCCCCAACCGTCAGAAC3′ 5′AGCCCAAACCCATCAACCTA3′ SRY2 5′CCAGGGAACTGCTTGGGTA3′ 5′TGCTTCTCCACTTAGGCTCAA3′ HBB 5′TATCCCACTTACAAGGCAGGTT3′ 1GB/T25876—2010 5′GCAGACAACAGAGAACAAGAATGA3′ 6 试剂和仪器 6.1 主要试剂 水应符合GB/T6682中灭菌双蒸水的要求。 TaqDNA聚合酶及PCR缓冲液、100bp梯度DNA标记物。 TE缓冲液、TAE缓冲液、加样缓冲液、溴化乙锭等。具体制备方法参见附录A。 6.2 主要仪器 冷冻离心机、梯度PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、电子天平、恒温水浴锅、双蒸馏水器、微 量移液器。 7 检测方法 7.1 试样的制备与保存 从待检胚胎中分离4个(或4个以上)细胞,用无菌超纯水冲洗3次后,放入0.5mLPCR管中,加 入10μL无菌超纯水,100℃煮沸10min~15min,立即置于碎冰中,冷却后4℃离心(8228g)5min,取 上清液保存于4℃冰箱中备用。 7.2 SRY基因片段PCR扩增 第一次扩增体系为20μL:0.8mmol/L的dNTP、2U的TaqDNA聚合酶、0.2μmol/L的SRY基 因外引物SRY1和内参照引物HBB、10×PCR缓冲液、2.5mmol/L的氯化镁,加适量双蒸水;反应程 序为95℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,20个循环结束后,72℃再延伸 10min,4℃保温2min~10min。 取第一次PCR扩增产物8μL,作为第二次扩增模板,同时加入10×PCR缓冲液、2.5mmol/L的 氯化镁、0.8mmol/L的dNTP1.6μL,2U的TaqDNA聚合酶、0.2μmol/L的SRY基因内引物 SRY2和内参照引物HBB、适量的双蒸水至20μL;反应程序为95℃预变性5min,94℃变性30s, 60℃退火30s,72℃延伸30s,34个循环后,72℃再延伸10min,4℃保温2min~10min。 7.3 结果判定 取5μLPCR扩增产物,1.0%~1.5%琼脂糖凝胶电泳(3V/cm~5V/cm,电泳20min~30min), 溴化乙锭染色,凝胶成像系统检查,电泳图谱见附录B中的图B.1。 电泳图谱中出现558bp(HBB扩增产物)和219bp(SRY扩增产物)条带,判定为雄性胚胎;电泳图 谱中只出现558bp条带,判定为雌性胚胎。 2GB/T25876—2010 附 录 A (资料性附录) 试剂和材料 表A.1 试剂和材料 试剂 配方 TE缓冲液 10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0) 10×PCR缓冲液 200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/L氯化钾,100mmol/L硫酸铵,15mmol/L氯化镁 琼脂糖电泳缓冲液 242.28gTris碱,57.1mL冰乙酸,100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),加双蒸水定容至 1000mL,使用时50倍稀释 加样缓冲液 0.25%溴酚蓝(质量浓度),40%蔗糖(质量浓度)。 溴化乙锭 100mL双蒸水中加入0.1g溴化乙锭,搅拌使完全溶解,转入棕色试剂瓶,锡箔包裹、备用GB/T25876—2010 GB/T25876—2010 附 录 B (规范性附录) SRY 基因和内参基因巢式PCR产物电泳图谱与结果判断示意图 M为100bp梯度DNA标记物; 泳道1~4均为雌性胚胎样本,检出558bp条带; 泳道5~8均为雄性胚胎样本,检出558bp和219bp两个条带。 图B.1 SRY 基因和内参基因巢式PCR产物电泳图谱与结果判读示意图 0102—67852T / BG