书 书 书犐犆犛 ６７ ． １２０ 犡 ０４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１３２１ — ２００７ 动物源食品中阿维菌素类药物 残留量的测定 免疫亲和  液相色谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犪狏犲狉犿犲犮狋犻狀狊狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀 — 犐犿犿狌狀狅犪犳犳犻狀犻狋狔犺犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺 ２００７  １０  ２９ 发布 ２００８  ０４  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国农业大学 、 中国检验检疫科学研究院 。 本标准主要起草人 ： 沈建忠 、 张素霞 、 李建成 、 曹兴元 、 王战辉 、 李晓薇 、 丁双阳 、 吴聪明 、 彭涛 、 国伟 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１３２１ — ２００７ 动物源食品中阿维菌素类药物 残留量的测定 免疫亲和  液相色谱法 １ 　 范围 本标准规定了动物源食品中阿维菌素类药物残留量检测的免疫亲和  液相色谱法 。 本标准适用于牛肝脏和牛肌肉组织样品中阿维菌素 、 伊维菌素 、 多拉菌素和埃普利诺菌素残留量的 测定 。 本标准的方法检测限 ： 阿维菌素 、 伊维菌素 、 多拉菌素和埃普利诺菌素均为 １ μ ｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ３ 　 原理 用甲醇提取试样中四种阿维菌素类药物 ， 经免疫亲和色谱柱净化 ， 用甲醇洗脱 。 洗脱液经氮气吹 干 ， 衍生化后 ， 用高效液相色谱  荧光检测法测定 ， 外标法定量 。 ４ 　 试剂和材料 除另有说明外 ， 所用试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ４ ． １ 　 甲醇 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ３ 　 磷酸二氢钾 。 ４ ． ４ 　 氯化钾 。 ４ ． ５ 　 磷酸氢二钠 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ ）。 ４ ． ６ 　 氯化钠 。 ４ ． ７ 　 乙酸酐 。 ４ ． ８ 　 １ 犖  甲基咪唑 ： 含量 ≥ ９９％ 。 ４ ． ９ 　 埃普利诺菌素标准品 ： 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． １０ 　 阿维菌素标准品 ： 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． １１ 　 多拉菌素标准品 ： 纯度 ≥ ９４．３％ 。 ４ ． １２ 　 伊维菌素标准品 ： 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． １３ 　 免疫亲和色谱柱 （ ＩＡＣ 柱 ）： 长 ４ｃｍ ， 内径 １ｃｍ ， ＩＡＣ 凝胶体积为 １ｍＬ 。 ４ ． １４ 　 组织稀释液 ： ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸盐缓冲液 （ ｐＨ７．４ ）。 称取磷酸二氢钾 （ ４．３ ） ０．２ｇ 、 氯化钾 （ ４．４ ） ０．２ｇ 、 磷酸氢二钠 （ ４．５ ） ２．９ｇ 、 氯化钠 （ ４．６ ） ８．８ｇ ， 用水溶解并稀释至 １Ｌ 。 ４ ． １５ 　 洗涤液 ： Ａ 液 、 Ｂ 液和 Ｃ 液 。 Ａ 液为 ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸盐缓冲液 （ ４．１４ ） ＋ 甲醇 （ ８０＋２０ ， 体积比 ）； Ｂ 液为 ２０％ 甲醇溶液 ； Ｃ 液为 ５０％ 甲醇溶液 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１３２１ — ２００７ ４ ． １６ 　 衍生化 Ａ 液 ： １ 犖  甲基咪唑 ＋ 乙腈 （ ２＋５ ， 体积比 ）， 现配现用 。 ４ ． １７ 　 衍生化 Ｂ 液 ： 乙酸酐 ＋ 乙腈 （ ３＋４ ， 体积比 ）， 现配现用 。 ４ ． １８ 　 埃普利诺菌素 、 阿维菌素 、 多拉菌素和伊维菌素标准储备液 ： １００ μ ｇ ／ ｍＬ 。 准确称取适量埃普利 诺菌素 、 阿维菌素 、 多拉菌素和伊维菌素标准品 （ ４．９ ～ ４．１２ ）， 分别用乙腈配成 １００ μ ｇ ／ ｍＬ 的标准储备 液 。 －２０℃ 保存六个月 。 ４ ． １９ 　 混合标准储备液 ： １ μ ｇ ／ ｍＬ 。 取四种标准储备液 （ ４．１８ ） 各 １．０ｍＬ 于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用乙腈 溶解并稀释至刻度 ， ４℃ 保存三个月 。 ４ ． ２０ 　 标准工作液 ： 分别量取适量上述混合标准储备液 （ ４．１９ ）， 用乙腈稀释成浓度为 １ 、 ５ 、 １０ 、 ２０ 、 ５０ 、 １００ 和 ２００ｎｇ ／ ｍＬ 的系列标准溶液 。 ５ 　 仪器 ５ ． １ 　 高效液相色谱仪 ： 配荧光检测器 。 ５ ． ２ 　 组织匀浆机 。 ５ ． ３ 　 离心机 。 ５ ． ４ 　 旋转蒸发仪 。 ５ ． ５ 　 涡动仪 。 ５ ． ６ 　 氮吹仪 。 ５ ． ７ 　 恒温加热器 。 ６ 　 试样制备与保存 取新鲜或解冻的动物组织 ， 剪碎 ， １００００ｒ ／ ｍｉｎ 匀浆 １ｍｉｎ 。 －２０℃ 下保存 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 提取 称取试样 １ｇ （ 精确到 ０．０１ｇ ）， 于 ３０ｍＬ 离心管中 ， 加 ４ｍＬ 甲醇 ， 涡动 １ｍｉｎ ， ３００ｒ ／ ｍｉｎ 振荡 ３０ｍｉｎ ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清液 。 残渣用 ４ｍＬ 甲醇重复提取 １ 次 ， 合并两次提取液 。 ７ ． ２ 　 净化 提取液中加 ２０ｍＬ 组织稀释液 （ ４．１４ ）， 涡动混合均匀后 ， 过 ＩＡＣ 柱 ， 自然重力下流出 ， 依次用洗涤 液 Ａ 液 ２０ｍＬ 、 Ｂ 液 １５ｍＬ 和 Ｃ 液 ３ｍＬ （ ４．１５ ） 洗涤 ， 用 ４ｍＬ 甲醇洗脱于试管中 ， ４０℃ 氮气吹干 。 ７ ． ３ 　 衍生化 试样残渣中加 １００ μ Ｌ 衍生化 Ａ 液 （ ４．１６ ）， 涡动 ０．５ｍｉｎ ， 再加 １００ μ Ｌ 衍生化 Ｂ 液 （ ４．１７ ）， 涡动 ０．５ｍｉｎ ， 密闭 ， 于 ９６℃ 恒温箱中衍生化反应 １００ｍｉｎ 。 取出 ， 冷却至室温 。 用乙腈稀释至 ２．５ｍＬ ， 过 ０．２ μ ｍ 滤膜 ， 进行 ＨＰＬＣ 分析 。 注 ： 标准溶液经氮气吹干后同法进行衍生化操作 。 ７ ． ４ 　 测定 ７ ． ４ ． １ 　 液相色谱条件 色谱柱 ： Ｃ １８ ， ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ ， 粒径 ５ μ ｍ ， 或相当者 。 流动相 ： 甲醇 ＋ 水 （ ９７＋３ ， 体积比 ）。 流速 ： １ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 柱温 ： ３０℃ 。 进样量 ： ２０ μ Ｌ 。 激发波长 ： ３６５ｎｍ 。 发射波长 ： ４７５ｎｍ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１３２１ — ２００７ ７ ． ４ ． ２ 　 液相色谱测定 分别取适量衍生化后的试样液和标准工作液进行液相色谱测定 ， 做单点校准或多点校准 ， 以色谱峰 的峰面积积分值定量 。 标准工作液及试样液中阿维菌素类药物的响应值均应在仪器检测的线性范围之 内 。 试样液测定过程中应参插标准工作液 ， 以便准确定量 。 标准品液相色谱图见附录 Ａ 。 ８ 　 结果计算 按式 （ １ ） 计算试样中阿维菌素类药物的含量 。 犡 ＝ 犮 × 犳 犿 …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犡 ——— 试样中阿维菌素类药物的残留量 ， 单位为微克每千克 （ μ ｇ ／ ｋｇ ）； 犮 ——— 试样液色谱峰对应的阿维菌素类药物浓度 ， 单位为微克每升 （ μ ｇ ／ Ｌ ）； 犳 ——— 稀释倍数 ； 犿 ——— 试样质量 ， 单位为克 （ ｇ ）。 注 ： 测定结果用平行测定后的算术平均值表示 ， 计算结果表示到小数点后两位 。 ９ 　 精密度 本方法的批内变异系数 ≤ ２０％ ， 批间变异系数 ≤ ３０％ 。 犌犅 ／ 犜 ２１３２１ — ２００７ 书书书 犌犅／犜２１３２１—２００７ 附　录　犃 （资料性附录） 色　谱　图 　　ＥＰ———埃普利诺菌素； ＡＶＭ———阿维菌素； ＤＯＲ———多拉菌素； ＩＶＭ———伊维菌素。 图犃．１　２μ犵／犔 阿维菌素类药物的标准溶液色谱图 ７００２ — １２３１２犜／犅犌