书 书 书犐犆犛 ６７ ． １２０ 犡 ０４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１３１７ — ２００７ 动物源性食品中四环素类兽药残留量 检测方法 　 液相色谱  质谱 ／ 质谱法 与高效液相色谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋犲狋狉犪犮狔犮犾犻狀犲狊狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀 — 犔犆犕犛 ／ 犕犛犿犲狋犺狅犱犪狀犱犎犘犔犆犿犲狋犺狅犱 ２００７  １０  ２９ 发布 ２００８  ０４  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 、 附录 Ｂ 和附录 Ｃ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 、 中国检验检疫科学研究院 。 本标准主要起草人 ： 岳振峰 、 谢丽琪 、 叶卫翔 、 吉彩霓 、 林秀云 、 邱月明 、 赵凤娟 、 陈沛金 、 周亚敏 。 本标准系首次发布 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１３１７ — ２００７ 动物源性食品中四环素类兽药残留量 检测方法 　 液相色谱  质谱 ／ 质谱法 与高效液相色谱法 １ 　 范围 本标准规定了动物源性食品中四环素类兽药残留量检测的制样方法 、 高效液相色谱检测方法和液 相色谱  质谱 ／ 质谱确证方法 。 本标准适用于动物肌肉 、 内脏组织 、 水产品 、 牛奶等动物源性食品中二甲胺四环素 、 土霉素 、 四环素 、 去甲基金霉素 、 金霉素 、 甲烯土霉素 、 强力霉素 ７ 种四环素类兽药残留量的高效液相色谱测定和二甲胺 四环素 、 差向土霉素 、 土霉素 、 差向四环素 、 四环素 、 去甲基金霉素 、 差向金霉素 、 金霉素 、 甲烯土霉素 、 强 力霉素 １０ 种四环素类药物残留量的液相色谱  质谱 ／ 质谱测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ３ 　 原理 试样中四环素族抗生素残留用 ０．１ｍｏｌ ／ ＬＮａ ２ ＥＤＴＡＭｃｌｌｖａｉｎｅ 缓冲液 （ ｐＨ＝４．０±０．０５ ） 提取 ， 经 过滤和离心后 ， 上清液用 ＨＬＢ 固相萃取柱净化 ， 高效液相色谱仪或液相色谱电喷雾质谱仪测定 ， 外标 峰面积法定量 。 ４ 　 试剂和材料 除另有说明外 ， 所用试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ４ ． １ 　 甲醇 ： 高效液相色谱纯 。 ４ ． ２ 　 乙腈 ： 高效液相色谱纯 。 ４ ． ３ 　 乙酸乙酯 。 ４ ． ４ 　 乙二胺四乙酸二钠 （ Ｎａ ２ ＥＤＴＡ · ２Ｈ ２ Ｏ ）。 ４ ． ５ 　 三氟乙酸 。 ４ ． ６ 　 柠檬酸 （ Ｃ ６ Ｈ ８ Ｏ ７ · Ｈ ２ Ｏ ）。 ４ ． ７ 　 磷酸氢二钠 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ ）。 ４ ． ８ 　 柠檬酸溶液 ： ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ 。 称取 ２１．０１ｇ 柠檬酸 （ ４．６ ）， 用水溶解 ， 定容至 １０００ｍＬ 。 ４ ． ９ 　 磷酸氢二钠溶液 ： ０．２ｍｏｌ ／ Ｌ 。 称取 ２８．４１ｇ 磷酸氢二钠 （ ４．７ ）， 用水溶解 ， 定容至 １０００ｍＬ 。 ４ ． １０ 　 Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ 缓冲溶液 ： 将 １０００ｍＬ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ 柠檬酸溶液 （ ４．８ ） 与 ６２５ｍＬ０．２ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸氢二 钠溶液 （ ４．９ ） 混合 ， 必要时用氢氧化钠或盐酸调节 ｐＨ＝４．０±０．０５ 。 ４ ． １１ 　 Ｎａ ２ ＥＤＴＡＭｃｌｌｖａｉｎｅ 缓冲溶液 ： ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ 。 称取 ６０．５ｇ 乙二胺四乙酸二钠 （ ４．４ ） 放入 １６２５ｍＬＭｃｌｌｖａｉｎｅ 缓冲溶液 （ ４．１０ ） 中 ， 使其溶解 ， 摇匀 。 ４ ． １２ 　 甲醇 ＋ 水 （ １＋１９ ）： 量取 ５ｍＬ 甲醇 （ ４．１ ） 与 ９５ｍＬ 水混合 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１３１７ — ２００７ ４ ． １３ 　 甲醇 ＋ 乙酸乙酯 （ １＋９ ）： 量取 １０ｍＬ 甲醇 （ ４．１ ） 与 ９０ｍＬ 乙酸乙酯 （ ４．３ ） 混合 。 ４ ． １４ 　 ＯａｓｉｓＨＬＢ 固相萃取柱 ： ６０ｍｇ ， ３ｍＬ ， 或相当者 。 使用前分别用 ５ｍＬ 甲醇和 ５ｍＬ 水预处理 ， 保持柱体湿润 。 ４ ． １５ 　 三氟乙酸水溶液 （ １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）： 准确吸取 ０．７６５ｍＬ 三氟乙酸于 １０００ｍＬ 容量瓶中 ， 用水溶解并 定容至刻度 。 ４ ． １６ 　 甲醇 ＋ 三氟乙酸水溶液 （ １＋１９ ）： 量取 ５０ｍＬ 甲醇 （ ４．１ ） 与 ９５０ｍＬ 三氟乙酸水溶液 （ ４．１５ ） 混合 。 ４ ． １７ 　 标准物质 ： 二甲胺四环素 （ ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ ， ＣＡＳ ： １０１１８９０８ ）， 土霉素 （ ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ， ＣＡＳ ： ６１５３６４６ ）， 四环素 （ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ， ＣＡＳ ： ６０５４８ ）， 去甲基金霉素 （ ｄｅｍｅｃｌｏｃｙｃｌｉｎｅ ， ＣＡＳ ： １２７３３３ ）， 金霉素 （ ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ， ＣＡＳ ： ５７６２５ ）， 甲烯土霉素 （ ｍｅｔｈａｃｙｃｌｉｎｅ ， ＣＡＳ ： ９１４００１ ）， 强力霉素 （ ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ ， ＣＡＳ ： ５６４２５０ ）， 差向四环素 （ ４ｅｐｉｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ， ＣＡＳ ： ６４７５５ ）， 差向土霉素 （ ４ｅｐｉｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ， ＣＡＳ ： ３５２５９３９３ ）， 差向金霉素 （ ４ｅｐｉｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙ ｃｌｉｎｅ ， ＣＡＳ ： １４２９７９３９ ）。 纯度均大于等于 ９５％ 。 ４ ． １８ 　 标准溶液 ４ ． １８ ． １ 　 标准储备溶液 ： 准确称取按其纯度折算为 １００％ 质量的二甲胺四环素 、 土霉素 、 四环素 、 去甲基 金霉素 、 金霉素 、 甲烯土霉素 、 强力霉素 、 差向土霉素 、 差向四环素和差向金霉素各 １０．０ｍｇ ， 分别用甲醇 溶解并定容至 １００ｍＬ ， 浓度相当于 １００ｍｇ ／ Ｌ ， 储备液在 －１８℃ 以下贮存于棕色瓶中 ， 可稳定 １２ 个 月以上 。 ４ ． １８ ． ２ 　 混合标准工作溶液 ： 根据需要 ， 用甲醇 ＋ 三氟乙酸水溶液 （ ４．１６ ） 将标准储备溶液 （ ４．１８．１ ） 配 制为适当浓度的混合标准工作溶液 。 混合标准工作溶液应使用前配制 。 ５ 　 仪器 ５ ． １ 　 液相色谱串联四极杆质谱仪或相当者 ， 配电喷雾离子源 。 ５ ． ２ 　 高效液相色谱仪 ： 配二极管阵列检测器或紫外检测器 。 ５ ． ３ 　 分析天平 ： 感量 ０．１ｍｇ ， ０．０１ｇ 。 ５ ． ４ 　 旋涡混合器 。 ５ ． ５ 　 低温离心机 ： 最高转速 ５０００ｒ ／ ｍｉｎ ， 控温范围为 －４０℃ 至室温 。 ５ ． ６ 　 吹氮浓缩仪 。 ５ ． ７ 　 固相萃取真空装置 。 ５ ． ８ 　 ｐＨ 计 ： 测量精度 ±０．０２ 。 ５ ． ９ 　 组织捣碎机 。 ５ ． １０ 　 超声提取仪 。 ６ 　 样品制备与贮存 制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化 。 ６ ． １ 　 动物肌肉 、 肝脏 、 肾脏和水产品 从所取全部样品中取出约 ５００ｇ ， 用组织捣碎机充分捣碎均匀 ， 装入洁净容器中 ， 密封 ， 并标明标记 ， 于 －１８℃ 以下冷冻存放 。 ６ ． ２ 　 牛奶样品 从所取全部样品中取出约 ５００ｇ ， 充分混匀 ， 装入洁净容器中 ， 密封 ， 并标明标记 ， 于 －１８℃ 以下冷冻 存放 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１３１７ — ２００７ ７ 　 测定步骤 ７ ． １ 　 提取 ７ ． １ ． １ 　 动物肝脏 、 肾脏 、 肌肉组织 、 水产品 称取均质试样 ５ｇ （ 精确到 ０．０１ｇ ）， 置于 ５０ｍＬ 聚丙烯离心管中 ， 分别用约 ２０ｍＬ 、 ２０ｍＬ 、 １０ｍＬ０．１ｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡＭｃｌｌｖａｉｎｅ 缓冲溶液 （ ４．１１ ） 冰水浴超声提取三次 ， 每次旋涡混合 １ｍｉｎ ， 超声 提取 １０ｍｉｎ ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ （ 温度低于 １５℃ ）， 合并上清液 （ 注意控制总提取液的体积不超过 ５０ｍＬ ）， 并定容至 ５０ｍＬ ， 混匀 ， ５０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ （ 温度低于 １５℃ ）， 用快速滤纸过滤 ， 待净化 。 ７ ． １ ． ２ 　 牛奶 称取混匀试样 ５ｇ （ 精确到 ０．０１ｇ ）， 置于 ５０ｍＬ 比色管中 ， 用 ０．１ｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡＭｃｌｌｖａｉｎｅ 缓冲溶 液 （ ４．１１ ） 溶解并定容至 ５０ｍＬ ， 旋涡混合 １ｍｉｎ ，