书 书 书犐犆犛 ６７ ． １８０ ． １０ 犅 ４７ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１１６４ — ２００７ 蜂王浆中链霉素 、 双氢链霉素残留量测定 液相色谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狊狋狉犲狆狋狅犿狔犮犻狀 、 犱犻犺狔犱狉狅狊狋狉犲狆狋狅犿狔犮犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔 — 犔犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔犿犲狋犺狅犱 ２００７  １０  ３１ 发布 ２００８  ０４  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国江苏出入境检验检疫局 、 中国兽医药品监察所 。 本标准主要起草人 ： 陈惠兰 、 吴斌 、 赵增运 、 沈崇钰 、 丁涛 、 黄娟 、 朱成晶 、 徐锦忠 、 蒋原 、 陶宏锦 、 朱馨乐 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１１６４ — ２００７ 蜂王浆中链霉素 、 双氢链霉素残留量测定 液相色谱法 １ 　 范围 本标准规定了蜂王浆中链霉素和双氢链霉素残留的液相色谱  柱后衍生化荧光测定方法 。 本标准适用于蜂王浆中链霉素和双氢链霉素残留量的测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ３ 　 方法提要 蜂王浆样品中链霉素和双氢链霉素用庚烷磺酸钠  磷酸钠混合提取液提取 ， 提取液用 Ｃ １８ 固相萃取 柱净化 ， 甲醇洗脱 ， 旋转蒸发至干 ， 用 ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ 庚烷磺酸钠溶液溶解定容 ， 样品溶液经高效液相色谱  柱后衍生 ， 荧光检测器检测 ， 外标法定量 。 ４ 　 试剂和材料 ４ ． １ 　 甲醇 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ 　 水 ： 应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ４ ． ３ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ４ 　 氢氧化钠 ： 分析纯 。 ４ ． ５ 　 三氯甲烷 ： 分析纯 。 ４ ． ６ 　 １ ， ２ 萘醌 ４ 磺酸钠 ： 色谱纯 。 ４ ． ７ 　 叔丁基甲基醚 ： 色谱纯 。 ４ ． ８ 　 正己烷 ： 分析纯 。 ４ ． ９ 　 庚烷磺酸钠 ： 色谱纯 。 ４ ． １０ 　 磷酸钠 ： 分析纯 。 ４ ． １１ 　 磷酸 ： 分析纯 。 ４ ． １２ 　 链霉素和双氢链霉素标准物质 ： 纯度 ≥ ９９％ 。 ４ ． １３ 　 Ｃ １８ 固相萃取柱 ： ５００ｍｇ ， ３ｍＬ 。 使用前用 ５ｍＬ 甲醇 １０ｍＬ 水预洗并保持柱体湿润 。 ４ ． １４ 　 庚烷磺酸钠  磷酸钠混合提取液 ： 称取 １０．１０ｇ 庚烷磺酸钠 、 ４．１０ｇ 磷酸钠 ， 溶于 １０００ｍＬ 水中 ， 用磷酸 （ ４．１１ ） 调溶液 ｐＨ３．３ 。 ４ ． １５ 　 叔丁基甲基醚  正己烷溶液 ： 取 １０ｍＬ 正己烷 、 ４０ｍＬ 叔丁基甲基醚 ， 混匀 。 ４ ． １６ 　 庚烷磺酸钠溶液 ： ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ 。 称取 ２．０２ｇ 庚烷磺酸钠 ， 溶于 １０００ｍＬ 水中 ， 用磷酸 （ ４．１１ ） 调 ｐＨ３．３ 。 ４ ． １７ 　 氢氧化钠溶液 ： ０．２ｍｏｌ ／ Ｌ 。 称取 ８ｇ 氢氧化钠 （ ４．４ ）， 溶于 １０００ｍＬ 水中 ， 过 ０．４５ μ ｍ 的滤膜 ， 抽滤脱气 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１１６４ — ２００７ ４ ． １８ 　 １ ， ２ 萘醌 ４ 磺酸钠溶液 ： ０．６ｍｍｏｌ ／ Ｌ 。 称取 ０．０７８ｇ１ ， ２ 萘醌 ４ 磺酸钠 （ ４．６ ）， 用 ５００ｍＬ 水溶 解 ， 过 ０．４５ μ ｍ 的滤膜 ， 抽滤脱气 。 ４ ． １９ 　 链霉素和双氢链霉素标准储备溶液 ： ０．１０ｍｇ ／ ｍＬ 。 准确称取适量的链霉素和双氢链霉素标准 品 ， 用水溶解定容 ， 配制成 ０．１０ｍｇ ／ ｍＬ 的标准储备液 。 储备液贮存在 ４℃ 冰箱中 ， 保存期一年 。 ４ ． ２０ 　 链霉素和双氢链霉素标准工作溶液 ： 根据试验需要 ， 用庚烷磺酸钠溶液 （ ４．１６ ） 稀释标准储备液 （ ４．１９ ）， 配成适当浓度的标准工作溶液 ， 现用现配 。 ５ 　 仪器 ５ ． １ 　 高效液相色谱仪配柱后衍生装置和荧光检测器 ， Ｐｅｋｅｒｉｎｇ 双通道柱后衍生装置或相当者 。 ５ ． ２ 　 旋涡混匀器 。 ５ ． ３ 　 固相萃取装置 。 ５ ． ４ 　 旋转蒸发器 。 ５ ． ５ 　 离心机 。 ５ ． ６ 　 真空泵 ： 真空度应达到 ８０ｋＰａ 。 ５ ． ７ 　 ｐＨ 计 ： 测量精度 ±０．０２ 。 ５ ． ８ 　 具塞离心管 ： ５０ｍＬ 。 ５ ． ９ 　 移液管 ： ２０．０ｍＬ 、 １０．０ｍＬ 、 １．０ｍＬ 。 ５ ． １０ 　 滤膜过滤器 ： ０．４５ μ ｍ ， 水相 。 ６ 　 试样的制备与保存 ６ ． １ 　 试样的制备 将样品解冻搅拌均匀 ， 分出 ０．５ｋｇ 作为试样 。 制备好的试样置于样品瓶中 ， 密封 ， 并标明标记 。 ６ ． ２ 　 试样保存 将试样于 －１８℃ 以下保存 。 ７ 　 测定步骤 ７ ． １ 　 提取 称取 ５ｇ 试样 ， 精确到 ０．０１ｇ ， 置于 ５０ｍＬ 离心管中 。 准确加入 ２０．０ｍＬ 提取液 （ ４．１４ ）， １０ｍＬ 三 氯甲烷 （ ４．５ ）， 在混匀器上混合 ２ｍｉｎ ， 混匀后于 ２０００ｒ ／ ｍｉｎ 下离心 ５ｍｉｎ ， 上清液待净化 。 ７ ． ２ 　 净化 将储液器装在预洗好的 Ｃ １８ 固相萃取柱 （ ４．１３ ） 上 。 准确移取 １０．０ｍＬ 上清液 （ ７．１ ） 于储液器中 ， 使 溶液以 １．５ｍＬ ／ ｍｉｎ 的流速通过 Ｃ １８ 固相萃取柱 。 用 １０ｍＬ 水淋洗 Ｃ １８ 固相萃取柱 ， 在真空泵 ７０ｋＰａ 的 负压下 ， 负压抽干 ５ｍｉｎ ， 再用 ４ｍＬ 叔丁基甲醚  正己烷混合溶液 （ ４．１５ ） 淋洗固相萃取柱 ， 负压抽干 ５ｍｉｎ ， 弃去全部淋洗液 。 用 １０ｍＬ 甲醇以 １．５ｍＬ ／ ｍｉｎ 的流速洗脱链霉素和双氢链霉素于 ５０ｍＬ 离 心管中 ， 用旋转蒸发器于 ４５℃ 水浴上将其减压蒸发至干 。 准确加入 １．０ｍＬ 庚烷磺酸钠溶液 （ ４．１６ ） 溶 解残渣 ， 溶液过 ０．４５ μ ｍ 的滤膜 ， 供液相色谱测定 。 ７ ． ３ 　 测定 ７ ． ３ ． １ 　 液相色谱条件 ａ ） 　 色谱柱 ： ＫｒｏｍａｓｉｌＣ ８ ５ μ ｍ ， ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ （ 内径 ）， 或相当者 ； ｂ ） 　 流动相 ： ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ 庚烷磺酸钠 （ ４．１６ ） ＋ 乙腈 （ ７７＋２３ ）； ｃ ） 　 流速 ： １．０ｍＬ ／ ｍｉｎ ； ｄ ） 　 柱温 ： ４５℃ ； ｅ ） 　 进样量 ： １００ μ Ｌ ； ２ 犌犅 ／ 犜 ２１１６４ — ２００７ ｆ ） 　 荧光检测器 ： 激发波长 ２６３ｎｍ ， 发射波长 ４４７ｎｍ 。 ７ ． ３ ． ２ 　 柱后衍生化条件 ａ ） 　 柱后衍生剂 １ ： ０．６ｍｍｏｌ ／ Ｌ１ ， ２ 萘醌 ４ 磺酸钠 （ ４．１８ ）， 流速 ０．３ｍＬ ／ ｍｉｎ ； ｂ ） 　 柱后衍生剂 ２ ： ０．２ｍｏｌ ／ Ｌ 氢氧化钠 （ ４．１７ ）， 流速 ０．３ｍＬ ／ ｍｉｎ ； ｃ ） 　 衍生温度 ： ５０℃ 。 ７ ． ３ ． ３ 　 色谱测定 根据样品溶液中链霉素和双氢链霉素的残留量 ， 选择峰面积相近的标准工作溶液 。 标准工作溶液 和样品溶液中链霉素和双氢链霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内 。 对标准工作溶液和样品溶 液等体积参插进样进行测定 ， 在上述色谱条件下 ， 链霉素的保留时间约为 ３４．２ｍｉｎ ， 双氢链霉素的保留 时间约为 ３５．６ｍｉｎ 。 链霉素和双氢链霉素标准物质的色谱图见图 Ａ．１ 。 ７ ． ４ 　 空白试验 除不加入试样外 ， 均按上述步骤进行 。 ８ 　 结果计算 结果用色谱数据处理机或按式 （ １ ） 计算 ， 计算结果需扣除空白值 ： 犡 ＝ 犃 · 犮 · 犞 犃 ｓ · 犿 ……………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犡 ——— 试样中链霉素 （ 双氢链霉素 ） 的含量 ， 单位为毫克每千克 （ ｍｇ ／ ｋｇ ）； 犃 ——— 样液中链霉素 （ 双氢链霉素 ） 的峰面积 ； 犮 ——— 标准工作溶液中链霉素 （ 双氢链霉素 ） 浓度 ， 单位为微克每毫升 （ μ ｇ ／ ｍＬ ）； 犞 ——— 样液定容体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犃 ｓ ——— 标准溶液中链霉素 （ 双氢链霉素 ） 的峰面积 ； 犿 ——— 最终样液代表的试样质量 ， 单位为克 （ ｇ ）。 ９ 　 检测低限 、 回收率 ９ ． １ 　 检测低限 蜂王浆中链霉素的检测低限为 ０．０２０ｍｇ ／ ｋｇ ， 双氢链霉素的检测