书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１１０８ — ２００７ 饲料中氯霉素的测定 高效液相色谱串联质谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犮犺狅狉犪犿狆犺犲狀犻犮狅犾犻狀犳犲犲犱狊 — 犎犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔狋犪狀犱犲犿犿犪狊狊狊狆犲犮狋狅犿犲狋狉狔 ２００７  １０  ２４ 发布 ２００８  ０４  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 、 附录 Ｂ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 、 国家饲料质量监督检验中心 （ 北京 ）。 本标准主要起草人 ： 赵根龙 、 高生 、 宋荣 、 张发旺 。 本标准首次发布 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１１０８ — ２００７ 饲料中氯霉素的测定 高效液相色谱串联质谱法 １ 　 范围 本标准规定了测定饲料中氯霉素的高效液相色谱串联质谱法 （ ＬＣ ／ ＭＳ ／ ＭＳ ）。 本标准适用于配合饲料和预混合饲料中氯霉素的测定 ， 其最低定量限为 １０ μ ｇ ／ ｋｇ ， 最低检测浓度 为 ５ μ ｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 （ ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ — ２００５ ， ＩＳＯ６４９７ ： ２００２ ， ＩＤＴ ） ３ 　 原理 饲料中的氯霉素用乙酸乙酯提取 ， 取部分提取液用氮气吹干 。 残渣溶于甲醇氯化钠溶液 ， 用正己烷 萃取除去脂溶性杂质 。 再将氯霉素回提至乙酸乙酯 ， 吹干 。 用乙腈水溶液溶解 ， 过 Ｃ １８ 小柱净化 。 最后 用 ＬＣ ／ ＭＳ ／ ＭＳ 法分离 、 检测和定量 。 ４ 　 试剂与材料 除非另有规定 ， 仅使用分析纯试剂 。 水为蒸馏水 ， 色谱用水符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 的一级用水的规定 。 ４ ． １ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ 　 甲醇 ： 色谱纯 。 ４ ． ３ 　 乙酸乙酯 。 ４ ． ４ 　 正己烷 。 ４ ． ５ 　 三氯甲烷 。 ４ ． ６ 　 乙腈溶液 ４ ． ６ ． １ 　 乙腈溶液 Ⅰ ： 取 ５．０ｍＬ 乙腈加水 ９５ｍＬ 。 ４ ． ６ ． ２ 　 乙腈溶液 Ⅱ ： 吸取乙腈 ５０ｍＬ 加水 ５０ｍＬ 。 ４ ． ７ 　 氯化钠 。 ４ ． ８ 　 氯化钠溶液 ： 浓度为 ４０ｇ ／ Ｌ ， 称取 ４０．０ｇ 氯化钠 （ ４．７ ） 加水溶解定容到 １０００ｍＬ 。 ４ ． ９ 　 氯化钠甲醇溶液 ： 取 ２００ｍＬ 甲醇 （ ４．２ ） 加氯化钠溶液 （ ４．８ ） ８００ｍＬ 。 ４ ． １０ 　 氯霉素标准品 ： 纯度大于 ９８％ 。 ４ ． １１ 　 氯霉素标准液 ４ ． １１ ． １ 　 标准贮备液 ： 准确称取 １００ｍｇ±０．１ｍｇ 氯霉素标准品 （ ４．１０ ） 用乙腈溶解 ， 定容到 １００ｍＬ ， 该 溶液氯霉素浓度为 １ｍｇ ／ ｍＬ ， 密封贮于冰箱内 ， 有效期为一年 。 ４ ． １１ ． ２ 　 标准中间液 Ⅰ ： 吸取标准贮备液 （ ４．１１．１ ） ５．００ｍＬ ， 于 ５０ｍＬ 容量瓶内 ， 用乙腈溶液 Ⅱ （ ４．６．２ ） 定容至 ５０ｍＬ ， 该溶液氯霉素浓度为 １００ μ ｇ ／ ｍＬ ， 密封贮于冰箱内 ， 有效期 ３ 个月 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１１０８ — ２００７ ４ ． １１ ． ３ 　 标准中间液 Ⅱ ： 吸取标准中间液 Ⅰ （ ４．１１．２ ） １．００ｍＬ 于 １００ｍＬ 容量瓶内 ， 用乙腈溶液 Ⅱ （ ４．６．２ ） 定容至 １００ｍＬ ， 该溶液氯霉素浓度为 １．０ μ ｇ ／ ｍＬ ， 密封贮于冰箱内 ， 有效期为 ３ 个月 。 ４ ． １１ ． ４ 　 标准中间液 Ⅲ ： 吸取标准中间液 Ⅱ （ ４．１１．３ ） １０．００ｍＬ 于 １００ｍＬ 容量瓶内 ， 用乙腈溶液 Ⅱ （ ４．６．２ ） 定容至 １００ｍＬ 。 该溶液氯霉素浓度为 １００ｎｇ ／ ｍＬ ， 密封贮于冰箱内 ， 有效期为 ７ 天 。 ４ ． １１ ． ５ 　 标准工作溶液 ： 用移液管分别吸取标准中间液 Ⅲ （ ４．１１．４ ） １ 、 ５ 、 １０ 、 ５０ｍＬ 于 ４ 个 １００ｍＬ 容量 瓶内 ， 用乙腈溶液 Ⅱ （ ４．６．２ ） 定容至刻度 。 该溶液氯霉素浓度为 １．０ 、 ５．０ 、 １０ 、 ５０ｎｇ ／ ｍＬ 。 ４ ． １２ 　 Ｃ １８ 固相萃取 （ ＳＰＥ ） 小柱 ： 载体 ２００ｍｇ 、 承载液体体积 ３ｍＬ 。 ５ 　 仪器 ５ ． １ 　 离心机 ： 转速为 ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 以上 。 ５ ． ２ 　 超声波提取器 。 ５ ． ３ 　 涡旋混合器 。 ５ ． ４ 　 密封盖塑料离心管 ： ５０ｍＬ 。 ５ ． ５ 　 液相色谱串联质谱仪 ： 配备电喷雾离子源 （ ＥＳＩ ） 的液相色谱串联质谱仪 。 ６ 　 试样的制备 按 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 选取有代表性的实验室样品 ， 用四分法缩分至约 ２００ｇ ， 粉碎过 ０．４５ｍｍ 孔径 筛 ， 混合均匀 ， 装入磨口瓶中备用 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 提取 称取一定量的试样 （ 配合饲料 ５ｇ ， 预混合饲料 １ｇ ， 精确至 ０．００１ｇ ）， 置于 ５０ｍＬ 塑料离心管内 （ ５．４ ） 加 ４０．０ｍＬ 乙酸乙酯 （ ４．３ ） 盖好密封盖于涡旋混合器上混合 ２ｍｉｎ 。 放入超声波提取器中提取 ２０ｍｉｎ ， 其间用手摇动两次 。 将离心管取出 ， 置离心机上 （ ５．１ ） ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心分离 ４ｍｉｎ 。 用移液管 取上清液 ２０ｍＬ ， 于 ５０℃ 加热器上用氮气吹至近干 ， 待净化 。 ７ ． ２ 　 净化 ７ ． ２ ． １ 　 液  液分配净化 用氯化钠甲醇溶液 （ ４．９ ） ２ 、 １ 、 １ｍＬ 分三次溶解残渣 （ ７．１ ）， 均转移到同一个 １０ｍＬ 具塞试管内 。 加 ４ｍＬ 正己烷 ， 涡旋混合 ２ｍｉｎ ， 放入离心机于 ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ４ｍｉｎ ， 弃去上层正己烷 ， 重复上述操 作一次 。 水相加乙酸乙酯 （ ４．３ ） ３ｍＬ ， 涡旋混合 ２ｍｉｎ ， 放入离心机 ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ４ｍｉｎ 。 吸取上层 乙酸乙酯 ， 水相置另一个 ５ｍＬ 具塞试管内 ， 加乙酸乙酯 （ ４．３ ） ２ｍＬ 重复上述操作一次 。 吸取上层乙酸 乙酯 ， 置于上述同一个水相具塞试管内 ， 置加热器上 ５０℃ 下 ， 用氮气吹干 。 用 ３ｍＬ 乙腈溶液 Ⅰ （ ４．６．１ ） 溶解 ， 待 ＳＰＥ 小柱净化 。 ７ ． ２ ． ２ 　 犛犘犈 柱净化 每一试样各准备一支 Ｃ １８ 小柱 （ ４．１２ ）， 顺序用 ５ｍＬ 甲醇 ， ５ｍＬ 三氯甲烷 ， ５ｍＬ 甲醇和 １０ｍＬ 水预 清洗 Ｃ １８ 柱 。 将样液 （ ７．２．１ ） 过此小柱 （ 流速 ＜ １ｍＬ ／ ｍｉｎ ）， 用 ５ｍＬ 乙腈溶液 Ⅰ （ ４．６．１ ） 淋洗 ， 最后用 ３ｍＬ 乙腈溶液 Ⅱ （ ４．６．２ ） 洗脱 ， 收集洗脱液于 １０ｍＬ 具塞试管内 。 洗脱液加 ５ｍＬ 乙酸乙酯涡旋混合 １ｍｉｎ ， ２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ， 下层水相用乙酸乙酯重复萃取一次 ， 合并乙酸乙酯提取液于 ５ｍＬ 具塞试管 内 。 在加热器上 （ ５０℃ ） 用氮气吹干 ， 用 ２ｍＬ 乙腈溶液 Ⅱ （ ４．６．２ ） 溶解 ， 调节试样溶液浓度 ， 使上机浓度 不高于 １００ｎｇ ／ ｍＬ 。 ７ ． ３ 　 测定 ７ ． ３ ． １ 　 液相色谱条件 色谱柱 ： Ｃ １８ 柱 ， 柱长 １５０ｍｍ ， 柱内径 ２．１ｍｍ ， 粒度 ３．５ μ ｍ 或性能类似的分析柱 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１１０８ — ２００７ 柱温 ： 室温 。 流动相组成 ： 乙腈 ＋ 水 ＝３０＋７０ （ 犞 １ ＋ 犞 ２ ）。 流动相流速 ： ２５０ μ Ｌ ／ ｍｉｎ 。 进样量 ： １０ μ Ｌ 。 ７ ． ３ ． ２ 　 质谱条件 电喷雾离子源 （ ＥＳＩ ） 负离子方式检测 。 喷雾电压 ： ３５００Ｖ 。 壳气流速 ： ０．６８Ｌ ／ ｍｉｎ 。 辅助气流速 ： ３．６Ｌ ／ ｍｉｎ 。 毛细管温度 ： ３００℃ 。 母离子 ３２１ ， 二级子离子为 ２５７ 、 １５２ 、 １２１ 。 碰撞电压如表 １ ： 表 １ 　 氯霉素的子离子及其碰撞电压 母离子 子离子 碰撞压力 ／ ｅＶ ３２１ ２５７ ２３ ３２１ １５２ １８ ３２１ １２１ １２ ７ ． ３ ． ３ 　 试样的测定 在上述仪器条件下 ， 分别注入标准工作液 （ ４．１１．５ ） 和试样溶液 （ ７．２．２ ） １０ μ Ｌ ， 以保留时间和二级子 离子 （ ｍ ／ ｚ ） ２５７ 、