书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１０３５ — ２００７ 饲料安全性评价 喂养致畸试验 犉犲犲犱狊犪犳犲狋狔犲狏犪犾狌犪狋犻狅狀 — 犉犲犲犱犻狀犵狋犲狉犪狋狅犵犲狀犻犮犻狋狔狋犲狊狋 ２００７  ０６  ２１ 发布 ２００７  ０９  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准是在参阅了 ＧＢ１５１９３．１４ — ２００３ 致畸试验及国内外相关文献的基础上 ， 根据我国技术发展 水平研究制定的 。 本标准由农业部畜牧业司提出 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 。 本标准负责起草单位 ： 中国农业大学动物医学院 、 中国兽医药品监察所 。 本标准主要起草人 ： 沈建忠 、 肖希龙 、 黄齐颐 、 张素霞 、 吴聪明 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１０３５ — ２００７ 饲料安全性评价 喂养致畸试验 １ 　 范围 本标准规定了喂养致畸试验的基本技术要求 。 本标准适用于饲料和饲料添加剂的致畸性评价 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ１４９２２．１ 　 实验动物 　 寄生虫学等级及监测 ＧＢ１４９２２．２ 　 实验动物 　 微生物学等级及监测 ＧＢ１４９２４．１ 　 实验动物 　 配合饲料通用质量标准 ＧＢ１４９２４．２ 　 实验动物 　 配合饲料卫生标准 ＧＢ１４９２４．３ 　 实验动物 　 小鼠大鼠配合饲料 ＧＢ１４９２５ 　 实验动物 　 环境及设施 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 。 ３ ． １ 妊娠率 　 犵犲狊狋犪狋犻狅狀犻狀犱犲狓 妊娠鼠数占确认交配雌鼠数的百分比 。 ３ ． ２ 　 分娩率 　 狆犪狉狋狌狉犻狋犻狅狀犻狀犱犲狓 分娩活仔雌鼠数占妊娠鼠数的百分比 。 ３ ． ３ 　 死胎率 　 犳犲狋犪犾犿狅狉狋犪犾犻狋狔 死胎仔数占分娩胎仔总数的百分比 。 ３ ． ４ 畸胎出现率 　 犻狀犮犻犱犲狀犮犲狅犳狋犲狉犪狋犪 畸胎总数占活胎仔总数的百分比 。 ３ ． ５ 　 畸胎总数 　 狊狌犿狅犳狋犲狉犪狋犪 出现畸形的所有活胎仔数 。 ３ ． ６ 　 单项畸形出现率 　 犻狀犮犻犱犲狀犮犲狅犳狊犻狀犵犾犲狋犲狉犪狋狅狊犻狊 出现某种畸形的活胎仔数占活胎仔总数的百分比 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１０３５ — ２００７ ３ ． ７ 　 活胎仔平均畸形出现率 　 犿犲犪狀犻狀犮犻犱犲狀犮犲狅犳狋犲狉犪狋狅狊犻狊 畸形总数占活胎仔总数的百分比 。 ３ ． ８ 　 畸形总数 　 狊狌犿狅犳狋犲狉犪狋狅狊犻狊 所有活胎仔出现的各种畸形种类数 。 ３ ． ９ 　 母体畸胎出现率 　 犻狀犮犻犱犲狀犮犲狅犳狋犲狉犪狋犪狆犪狉狋狌狉犻狋犻狅狀 分娩畸胎的母体数占妊娠母体总数的百分比 。 ４ 　 试剂及其配制 除特别注明外 ， 本法所用试剂均为分析纯 ， 水为去离子水 ， 符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的二级用水要求 。 ４ ． １ 　 乙醇固定液 ： ９５％ 乙醇 。 ４ ． ２ 　 鲍因 （ Ｂｏｕｉｎｓ ） 固定液 ： 取饱和苦味酸溶液 ７５０ｍＬ 、 ４０％ 甲醛 ２５０ｍＬ 和乙酸 ５０ｍＬ 混合而成 。 ４ ． ３ 　 氢氧化钾溶液 ： 分别配制 １％ 和 ２％ 两种不同浓度的氢氧化钾溶液 。 ４ ． ４ 　 茜素红 （ ａｌｉｚａｒｉｎｒｅｄ ） 贮备液 ： 将茜素红加入 ５ｍＬ 乙酸 、 １０ｍＬ 纯甘油和 ６０ｍＬ１％ 水合氯醛的混 合液中至饱和 。 ４ ． ５ 　 茜素红应用液 ： 取茜素红贮备液 １ｍＬ ， 加 １％ 氢氧化钾溶液至 １０００ｍＬ ， 用前临时配制 。 ４ ． ６ 　 脱水透明液 Ａ ： 甘油 ２０ｍＬ 、 ２％ 氢氧化钾溶液 ３ｍＬ ， 加蒸馏水至 １００ｍＬ 。 ４ ． ７ 　 脱水透明液 Ｂ ： 甘油 ５０ｍＬ 、 ２％ 氢氧化钾溶液 ３ｍＬ ， 加蒸馏水至 １００ｍＬ 。 ５ 　 仪器与设备 ５ ． １ 　 实验室常用设备 。 ５ ． ２ 　 放大镜和解剖显微镜 。 ５ ． ３ 　 游标卡尺 （ 百分尺 ）。 ６ 　 实验动物及饲养管理 常用实验动物为大鼠 、 小鼠 。 首选大鼠 ， 雌雄比例为 １∶１ 或 ２∶１ ， 大鼠交配时约 １２ ～ １４ 周龄 ， 小鼠 ９ ～ １０ 周龄 。 使用清洁级大 鼠和小鼠应符合 ＧＢ１４９２２．１ 和 ＧＢ１４９２２．２ 的要求 。 实验动物饲养环境应符合 ＧＢ１４９２５ 的规定 ， 并注明动物饲养室的光照和通风条件 ， 每天记录温 度 、 湿度 。 笼养大鼠每笼不超过 ５ 只 。 饲料应符合 ＧＢ１４９２４．１ 、 ＧＢ１４９２４．２ 和 ＧＢ１４９２４．３ 的规定 。 ７ 　 剂量分组 至少设 ４ 组 ， 即 １ 个空白对照组 （ 或溶剂对照组 ） 和 ３ 个试验组 。 试验组剂量一般选择在 １ ／ １０ ～ １ ／ １００ 母体 ＬＤ ５０ 之间 。 高剂量一般应使母体产生中毒症状 ； 低剂量 应不引起母鼠产生可观察到的中毒症状 ； 在高剂量组与低剂量组之间设 １ 个 ～ ２ 个中剂量组 。 设 １ 个 空白对照组 （ 或溶剂对照组 ）， 必要时 ， 还要设阳性对照组 。 每组孕鼠不能低于 １２ 只 。 ８ 　 操作步骤 ８ ． １ 　 受试物给予与观察 一般采用混饲或混饮给予受试物 。 原则上雄鼠交配前 ４ 周 ～ ８ 周开始给予受试物直至交配成功 ， 确证雌鼠受孕为止 。 雌鼠从交配前 ２ 周 ～ ４ 周开始给予受试物至孕期的第 １３ 天 ～ 第 １５ 天 。 在试验期 间 ， 每天观察试验鼠的体征 、 行为活动 、 采食和饮水情况 。 每周至少称 １ 次体重 ， 并同时计算采食量 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１０３５ — ２００７ ８ ． ２ 　 受孕检查 雌 、 雄大鼠按 １∶１ （ 或 ２∶１ ） 同笼后 ， 每日早晨检查笼底有无阴道栓 （ 石蜡状圆柱体 ） 或用浸湿生理 盐水的棉签取阴道分泌物涂布于滴有 １ 滴生理盐水的玻片上 ， 置低倍显微镜下检查有无精子 。 发现阴 道栓或精子的当天定为孕期的 ０ｄ 。 一般每组应获得 １３ 只 ～ １５ 只受孕鼠 ， 以保证实验结束时妊娠母鼠 数不少于 １２ 只 。 ８ ． ３ 　 孕鼠称重 孕鼠于孕期的 ０ｄ 、 ７ｄ 、 １４ｄ 和 ２０ｄ 称重 ， 以观察孕鼠的体重变化 ， 随时注意记录孕鼠的状况 。 ８ ． ４ 　 孕鼠处死和检查 大鼠在孕期第 ２０ 天 （ 小鼠第 １９ 天 ） 将孕鼠处死 。 沿腹中线剖开腹腔 ， 取出子宫 。 分别检查并记录左 、 右侧卵巢黄体数 、 窝重 （ 子宫连胎鼠 ）、 子宫重 、 着床数 、 活胎数 、 死胎数 （ 含早期及晚期死胎 ） 和吸收胎数 。 ８ ． ５ 　 活胎鼠检查 逐个记录活胎鼠体重 、 性别 、 体长 ， 外观检查头颅外形 、 面部 、 躯干 、 四肢等有无畸形 ， 包括露脑 、 脑膨 出 、 眼部畸形 （ 小眼 、 无眼 、 睁眼等 ）、 鼻孔扩大 、 单鼻孔 、 唇裂 、 脊柱裂 、 四肢及尾畸形等等 。 ８ ． ６ 　 胎鼠骨标本制作与检查 将每窝二分之一的活胎 （ 奇数或偶数 ） 放入乙醇固定液 （ ４．１ ） 中固定 ２ 周 ～ ３ 周 。 取出胎仔 （ 可去 皮 、 去内脏及脂肪 ） 流水冲洗数分钟 ， 放入至少 ５ 倍于胎仔体积的 １％ ～ ２％ 氢氧化钾溶液 （ ４．３ ） 中作用 ８ｈ ～ ７２ｈ ， 然后将胎仔放入茜素红应用液 （ ４．５ ） 中染色 ６ｈ ～ ４８ｈ ， 并轻摇 １ 次 ／ ｄ ～ ２ 次 ／ ｄ ， 至头骨染红 为宜 。 再将胎仔放入透明液 Ａ （ ４．６ ） 中 １ｄ ～ ２ｄ ， 放入透明液 Ｂ （ ４．７ ） 中 ２ｄ ～ ３ｄ ， 待骨骼红染而软组织 基本褪色为止 。 将胎仔标本放入小平皿内 ， 用透射光源 ， 在体视显微镜下作整体观察 ， 逐步检查骨骼 。 检查时先测量囱门的大小 、 矢状缝的宽度 、 头顶间骨及后头骨缺损情况 ， 然后检查胸骨的数目 、 缺失 或融合 （ 胸骨为 ６ 个 ， 骨化不完全时首先缺第 ５ 胸骨 、 次缺第 ２ 胸骨 ）， 检查肋骨 （ 肋骨通常为 １２ 对 ～ １３ 对 ， 常见畸形有融合肋 、 分叉肋 、 波状肋 、 短肋 、 多肋 、 缺肋 、 肋骨断裂 ）， 检查脊柱发育 、 椎体数目 （ 颈椎 ７ 个 ， 胸椎 １２ 个 ～ １３ 个 ， 腰椎 ５ 个 ～ ６ 个 ， 骶椎 ４ 个 ， 尾椎 ３ 个 ～ ５ 个 ） 以及椎骨有无融合 、 纵裂等 ， 最后 检查四肢骨 。 ８ ． ７ 　 胎鼠内脏检查 将每窝二分之一的胎鼠放入鲍因固定液 （ ４．２ ） 中 ， 两周后作内脏检查 。 先用自来水冲去固定液 ， 将 鼠仰放在石蜡板上 ， 剪去四肢和尾 ， 用刀片从头部到尾部逐段横切或纵切 。 观察不同切面器官的大小 、 形状和相对位置 。 切面制作见图 １ 。 　　 １ ——— 经口从上腭与舌之间向枕部横切 （ 切面 １ ）， 可观察大脑 、 间脑 、 正脑 、 舌及颚裂 ； ２ ———