ICS DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 1185—2011 桑蚕微粒子病诊断技术规程 The technical regulations for diagnosis on pebrine of silkworm (Bombyx mori L.) 2011 - 01 - 25 发布 四川省质量技术监督局 2011 - 03 - 01 实施 发 布 DB51/T 1185—2011 目 次 前 言 .............................................................................. II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 试剂 .............................................................................. 1 4 仪器、设备 ........................................................................ 1 5 肉眼诊断 .......................................................................... 1 I DB51/T 1185—2011 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局发布。 本标准起草单位：四川省蚕业管理总站、四川省农业科学院生物技术核技术研究所。 本标准主要起草人：吴 钢、蔡平钟、朱洪顺、谢忠良、张学清、马露芸。 II DB51/T 1185—2011 桑蚕微粒子病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了四川省桑蚕微粒子病诊断技术要求。 本标准适用于四川省桑蚕微粒子病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20395 桑蚕微粒子病病原鉴定方法 DB51/T844 桑蚕微粒子病防治技术规程 3 试剂 3.1 浓盐酸[w(HCl)=30％]。 3.2 氢氧化钾溶液[w(KOH)=2％]。 3.3 过氧化氢溶液[w(H2O2)=10％]。 3.4 分析用水按 GB/T6682 规定执行。 4 仪器、设备 4.1 普通光学显微镜、相衬（相差）显微镜，放大倍数 15×40 倍或 16×40 倍；生化培养箱（温控范围 10 ℃～50 ℃）、冰箱；天平（感量：0.1 g）、离心机。 4.2 离心管、无纺布滤纸；载玻片、盖玻片、测微尺；容量瓶、量筒、烧杯、二重皿；乳钵、乳棒； 解剖剪、镊子、橡皮吸管；样品袋、冻存管（1.8 mL、5 mL）。 5 5.1 诊断 肉眼诊断 5.1.1 外观观察 通过肉眼观察，蚕的不同发育阶段是否具有下列症状： a) 小蚕期：收蚁后不疏毛、体色深暗、体躯瘦小、发育缓慢、重症死亡；群体发育不齐。 1 DB51/T 1185—2011 b) 大蚕期：表皮缩皱、体呈锈色；体壁出现微细不规则黑褐色病斑，以尾角末端、气门周围和胸 腹足外侧部位较多；蜕皮困难，严重死亡；群体发育不齐。 c) 蛹蛾期：蛹表皮无光泽、反应迟钝、腹部松弛，体壁出现微细不规则黑褐色病斑，感病严重的 不化蛾、死亡；蛾羽化展翅不良、鳞毛脱落、腹部膨大、节间松弛，交配能力差，产卵少。 d) 卵期：卵形不正，排列不齐、多重叠卵，卵产附差、易脱落，不受精卵和死卵多；催青期发育 不整齐。 5.1.2 解剖观察 将外观观察的具有上述大蚕期典型病症的病蚕，用解剖剪从背中线剪开，肉眼观察丝腺是否有乳白 色脓疱状斑块。 5.1.3 判定 通过外观观察，蚕的不同发育阶段出现 5.1.1 表述症状之一的，可疑似为蚕微粒子病；通过解剖观 察，大蚕期病蚕丝腺出现可见的乳白色脓疱状斑块时，可确诊为蚕微粒子病。 5.2 显微镜诊断 5.2.1 样品采集 采集 5.1.1 描述的典型症状蚕、蛹、蛾、卵。采集的样品置于样品袋或冻存管中，做好记载。 5.2.2 样品处置 5.2.2.1 样品保存 采集的样品每份混合均匀后再分成 2 份，其中 1 份作为检样按照 5.2.2.2 制备检验，另 1 份作为备 样，保存于 0 ℃～4 ℃冰箱中，保存期 30 d～60 d。 5.2.2.2 样本制备 5.2.2.2.1 不同发育时期的样品，按照下列方法制样： a) 蚁蚕样品置生化培养箱于温度 29 ℃±0.5 ℃、相对湿度≥85 %条件下，放置 2 d～3 d。 b) 小蚕期、大蚕期、蛹期、蛾期样品置生化培养箱于温度 29 ℃～32 ℃、相对湿度≥85％条件下， 放置 2 d～5 d；大蚕期、蛹期经高温处置的样品，可用解剖剪沿背中线剪开，摘取其中肠，每 1 头～5 头蚕或 1 粒～2 粒蛹的中肠为 1 个样。 c) 卵期样品解除滞育后，在生化培养箱温度 29 ℃±0.5 ℃、相对湿度≥85％的条件下催青；孵化 后待其自然死亡。 5.2.2.2.2 将上述制备的样本每份分别置于 1 个乳钵孔中，每孔各放 1 个乳棒，磨碎；滴入 4 滴～10 滴氢氧化钾溶液[w(KOH)= 2％]，再次研细。 5.2.2.2.3 5.2.3 按照乳钵序号，将磨碎液用乳棒点样至载玻片，盖上盖玻片，制成镜检样本。 显微镜检查 5.2.3.1 直接观察法 将镜检样本，置于显微镜（15×40 倍或 16×40 倍）下观察，每个样本观察不少于 20 个视野，观察 有无微粒子孢子。 2 DB51/T 1185—2011 5.2.3.2 离心沉淀法 将 5.2.2.2.2 制备的磨碎液，用无纺布滤纸过滤后，将滤液移入离心管中，经 3000 r/min 离心 3 min， 倾去上清夜，沉淀物振荡制镜检样本，置于显微镜（15×40 倍或 16×40 倍）下观察，每个样本观察不少 于 20 个视野，观察有无微粒子孢子。 5.2.3.3 酸溶解法 将检出有微粒子孢子的磨碎液吸取 2 滴，分别滴于载玻片两端，自然干燥后在其中 1 点加 1 滴浓盐 酸[w(HCl)=30％]，另 1 点作对照，在 30℃生化培养箱中放置 10 min～20 min 后，盖上盖玻片镜检（15×40 倍或 16×40 倍）。如果样本已干，可加无菌水 1 滴。经过酸处理的样本，微粒子孢子溶解消失，真菌孢 子保持原状。 5.2.3.4 过氧化氢法 将 5.2.3.1、5.2.3.2 镜检出有微粒子孢子原液吸取 1 滴，滴于载玻片上，再将过氧化氢溶液[w(H2O2)=10 ％]1 滴～2 滴滴于孢子液中，盖上盖玻片，经过 10 min～30 min，相衬（相差）显微镜镜检（15×40 倍 或 16×40 倍） ，活微粒子孢子释放出极丝。 5.2.4 判定 当镜检发现孢子呈长卵圆形，大小为3.6 μm～3.8 μm×2.0 μm～2.3 μm，呈淡绿色，折光性强，中 间隐约可见1根黑色线状物，表面光滑，孢子活泼，多左右摆动，有时可见翻滚现象时，孢子则为蚕微 粒子孢子（参见GB/T20395附录A微粒子孢子图），原样品确诊为蚕微粒子病。 加浓盐酸作用后，被溶解的孢子为微粒子孢子，原样品确诊为蚕微粒子病。 加过氧化氢作用后，活微粒子孢子释放出极丝，原样品确诊为蚕微粒子病。 _________________________________ 3