ICS 13.060.50 Z 16 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1499—2015 水产养殖环境中杆菌肽、粘菌素及 维吉尼霉素残留量的测定 Determination of Bacitracin, Colistin and Virginiamycin residues in aquaculture environment 2015-02-28 发布 福建省质量技术监督局 2015-06-01 实施 发 布 DB35/T 1499—2015 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由福建省海洋与渔业厅提出并归口。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准起草单位：福建省水产研究所、福建省渔业环境监测站、农业部渔业产品质量监督检验测试 中心（厦门）。 本标准主要起草人：罗冬莲、罗方方、钱卓真、汤水粉、叶玫、吴成业。 I DB35/T 1499—2015 水产养殖环境中杆菌肽、粘菌素及维吉尼霉素残留量的测定 警告：使用本标准的人员应有正规实验室工作的实验经验，应熟知下述化学处理操作和仪器操作安 全。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家 有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了水产养殖环境（水体和沉积物）中杆菌肽、粘菌素及维吉尼霉素M1残留量测定的高 效液相色谱-串联质谱法。 本标准适用于水产养殖环境（水体和沉积物）中杆菌肽、粘菌素及维吉尼霉素M1残留量的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB 17378.3-2007 海洋监测规范 第3部分：样品采集、贮存与运输 3 原理 水样经过滤、酸化后，采用固相萃取方法富集和净化；沉积物经甲醇-柠檬酸-磷酸氢二钠溶液超声 提取，乙二胺四乙酸二钠络合除杂，甲基异丁基甲酮萃取，固相萃取柱富集净化；高效液相色谱-串联 质谱法测定，基质匹配标准曲线法定量。 4 试剂和材料 1) 本标准所用试剂除非另有规定，使用的试剂为分析纯，水为GB/T 6682-2008规定的一级水。 4.1 硫酸粘菌素标准品：纯度≥78.3%。 4.2 杆菌肽标准品：纯度≥77.0%。 4.3 维吉尼霉素 M1 标准品：纯度≥95.0%。 4.4 甲醇：色谱纯。 4.5 甲酸：优级纯。 4.6 正己烷：色谱纯。 4.7 乙腈：色谱纯。 4.8 一水柠檬酸。 4.9 十二水磷酸氢二钠。 4.10 甲基异丁基甲酮：色谱纯。 1) 称取标准品的质量是按纯度修正过的质量。 1 DB35/T 1499—2015 4.11 乙二胺四乙酸二钠。 4.12 0.1 mol/L 的柠檬酸溶液：取一水柠檬酸（4.8）21.01 g，用水溶解并稀释至 1000 mL。 4.13 0.2 mol/L 的磷酸氢二钠溶液：取十二水磷酸氢二钠（4.9）71.63 g，用水溶解并稀释至 1000 mL。 4.14 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液：取 0.1 mol/L 的柠檬酸溶液（4.12）1000 mL 和 0.2 mol/L 的磷酸氢 二钠溶液（4.13）625 mL，混合均匀。 4.15 甲醇-柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液：取甲醇（4.4）300 mL 和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（4.14） 400 mL，混合均匀。 4.16 0.1%的甲酸甲醇溶液：取甲酸（4.5）1 mL，用甲醇（4.4）稀释至 1000 mL。 4.17 0.1%的甲酸水溶液：取甲酸（4.5）1 mL，用水稀释至 1000 mL。 4.18 定容液：取 0.1%甲酸水溶液（4.17）80 mL 和乙腈（4.7）20 mL，混合均匀。 4.19 0.1%甲酸乙腈溶液：取甲酸（4.5）1 mL，用乙腈（4.7）稀释至 1000 mL。 4.20 Oasis HLB 固相萃取柱：500 mg/6 mL；或相当者。 4.21 Oasis HLB 固相萃取柱：200 mg/6 mL；或相当者。 4.22 标准储备液：准确称取硫酸粘菌素（4.1）、杆菌肽（4.2）各 20 mg（精确至 0.1 mg）于 100 mL 棕色容量瓶中，用 0.1%的甲酸水溶液（4.17）溶解并稀释至刻度，配制成 200 mg/L 的混合标准储备液， 4 ℃下避光保存，有效期 1 个月；准确称取维吉尼霉素 M1（4.3）10 mg（精确至 0.1 mg）于 100 mL 棕 色容量瓶中，用甲醇（4.4）溶解并稀释至刻度，配制成 100 mg/L 的标准储备液，-18 ℃下避光保存， 有效期 6 个月。 4.23 混合标准中间液：准确移取 200 mg/L 粘菌素和杆菌肽混合标准储备液（4.22）1 mL 于 10 mL 棕 色容量瓶中，用 0.1%的甲酸水溶液（4.17）稀释至刻度，配制成 20 mg/L 的混合标准中间液，4 ℃下避 光保存，有效期 10 天；准确移取 100 mg/L 维吉尼霉素 M1 标准储备液（4.22）1 mL 于 10 mL 棕色容量 瓶中，用甲醇（4.4）稀释至刻度，配制成 10 mg/L 的标准中间液，4 ℃下避光保存，有效期 2 个月。 5 仪器与设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 6 高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。 分析天平：感量 0.1 mg。 天平：感量 0.01 g。 离心机：4000 r/min。 涡漩混合器：3000 r/min。 离心管：50 mL。 水浴氮吹仪。 水相滤膜：0.45 µm。 有机相针式过滤器：0.22 µm。 超声波清洗器。 真空泵。 固相萃取装置。 样品的采集、制备与保存 6.1 2 水样采集与保存 DB35/T 1499—2015 按GB 17378.3-2007的规定，将现场采集的1 L水样装入小口棕色玻璃瓶中，盖紧，避光运回实验室， 2 ℃～8 ℃保存。 6.2 沉积物采集、制备与保存 按GB 17378.3-2007的规定，将现场采集的500 g沉积物样品装入棕色广口玻璃瓶中，盖紧，避光运 回实验室。剔除沉积物中砾石和杂物，置阴凉通风处风干后，经研磨，过80目筛后，储于小口玻璃瓶中， 于阴凉处保存。 7 试样的前处理 7.1 水样前处理 水样抽滤过膜（5.8）。移取100 mL过滤的水样于三角瓶中，加入甲酸（4.5）调节pH至2.5～3.0。 Oasis HLB固相萃取柱（4.20）依次用甲醇（4.4）5 mL、水5 mL预活化，上样，水15 mL淋洗，控制流 速为每秒一滴，甲醇（4.4）3 mL洗脱，收集全部洗脱液于玻璃试管中，40 ℃氮吹至干。用定容液（4.18） 1 mL复溶，混匀，过0.22 µm有机相针式过滤器，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。 7.2 沉积物前处理 7.2.1 提取 称取5 g±0.05 g过筛后的沉积物样品于50 mL离心管内，依次加入乙二胺四乙酸二钠（4.11）0.5 g、 甲醇-柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（4.15）10 mL、2000 r/min涡旋混合1 min，超声提取10 min、3500 r/min 离心5 min，取上清液，残渣再加入甲醇-柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（4.15）10 mL重复提取1次，合并 上清液至另一50 mL离心管。 7.2.2 液-液萃取净化 上述清液（7.2.1）中加入甲基异丁基甲酮（4.10）5 mL，2000 r/min涡旋混合1 min，3500 r/min离心 5 min，将上层液转移至15 mL玻璃试管中，重复上述操作一次。合并两次甲基异丁基甲酮提取液于40 ℃ 氮吹至干，甲醇（4.4）1 mL复溶后与下层液合并，待固相萃取柱净化。 7.2.3 固相萃取净化 Oasis HLB固相萃取柱（4.21）依次用甲醇（4.4）5 mL、水5 mL预活化，上样，水10 mL淋洗，控 制流速为每秒一滴，甲醇（4.4）3 mL、0.1%甲酸甲醇溶液（4.16）3 mL依次洗脱，收集全部洗脱液于 玻璃试管中，40 ℃氮吹至干。用定容液（4.18）1 mL复溶，混匀，过0.22 µm有机相针式过滤器，供高 效液相色谱-串联质谱仪测定。 8 测定 8.1 8.1.1 8.1.2 8.1.3 8.1.4 液相色谱条件 色谱柱：CAPCELL PAK MGII C18 柱（2.0 mm×150 mm, 5 µm）或性能相当者。 流动相 A：0.1%甲酸水溶液。 流动相 B：0.1%甲酸乙腈溶液。 梯度洗脱程序见表 1。 3 DB35/T 1499—2015 表1 8.1.5 8.1.6 8.1.7 8.2 时间 A B min % % 0 90 10 2 90 10 4 25 75 9 25 75 10 90 10 12 90 10 流速：0.2 mL/min。 柱温：25 ℃。 进样量：10 µL。 质谱条件 8.2.1 8.2.2 8.2.3 8.2.4 8.2.5 8.2.6 8.2.7 8.2.8 离子源：电喷雾（ESI）离子源。 扫描方式：正离子扫描。 检测方式：多反应监测（MRM）。 电喷雾电压：4500 V。 毛细管温度：300 ℃。 雾化气压力：241.3 KPa。 辅助气压力：13.8 KPa。 定性离子对、定量离子对和碰撞能量见表 2。 表2 杆菌肽、粘菌素及维吉尼霉素 M1 的定性离子对、定量离子对和碰撞能量 化合物 杆菌肽 A（BTCA） 杆菌肽 B（BTCB） 粘菌素 A（CSA） 粘菌素 B（CSB） 维吉尼霉素 M1（VGM M1） 8.3 流动相梯度洗脱程序 定性离子对 定量离子对 碰撞能量 m/z m/z ev 712.0/198.8 712.0/226.7 705.0/198.8 705.0/252.8 391.0/384.8 391.0/378.8 386.0/379.9 386.0/374.1 525.3/337.0 525.3/355.0 712.0/198.8 705.0/198.8 391.0/384.8 386.0/379.9 525.3/337.0 39 30 39 48 11 14 10 14 20 15 基质匹配标准曲线的制备 准确移取适量