ICS 65.140 B 47 福 DB35 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1761—2018 蜜蜂黑蜂王台病诊断技术 Diagnostic techniques for Black Queen Cell Disease of Honey Bees 2018 - 04 - 03 发布 福建省质量技术监督局 2018 - 07 - 03 实施 发 布 DB35/T 1761—2018 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 缩略语 ............................................................................ 1 5 疾病概述 .......................................................................... 2 6 临床诊断 .......................................................................... 2 7 实验室诊断 ........................................................................ 2 8 综合判定 .......................................................................... 5 附录 A（规范性附录） 溶液的配制 ...................................................... 7 附录 B（资料性附录） 溶液的配制 ...................................................... 8 附录 C（资料性附录） 核酸扩增电泳图 .................................................. 9 I DB35/T 1761—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由福建出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心、福建农林大学、吉林出入境检验检疫 局、厦门瑞德利校准检测技术有限公司。 本标准主要起草人：张体银、郑腾、王武军、黄少康、宋战昀、张永东、张志灯、白泉阳、林杰、 于师宇。 II DB35/T 1761—2018 蜜蜂黑蜂王台病诊断技术 1 范围 本标准规定了蜜蜂黑蜂王台病临床诊断、实验室诊断和综合判定。 本标准适用于蜜蜂黑蜂王台病的诊断和蜜蜂黑蜂王台病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 王台 queen cell 候选蜂王的寝宫，即工蜂为培育蜂王所筑成的巢房。 注：王台亦名“母蜂房”。 3.2 黑蜂王台病 black queen cell disease 由蜜蜂黑蜂王台病毒（Black queen cell virus）引起的蜂王幼虫及蛹感染，并可导致巢房变黑， 进而引发蜜蜂大量死亡的一种严重的蜜蜂病毒病。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BQCV：黑蜂王台病毒（Black queen cell virus） Ct：循环阈值（Cycle threshold） DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethy pyrocarbonate） dNTP：三磷酸脱氧核苷酸（Deoxynucleoside triphosphate） EB：溴化乙锭（Ethidium bromide） RNA：核糖核酸（Ribonucleic acid） RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction） TBE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（Trihydroxymethyl aminomethane-boric acidethylene diamine tetraacetic acid ） 1 DB35/T 1761—2018 5 疾病概述 蜜蜂黑蜂王台病（Black queen cell disease）是由黑蜂王台病毒(Black queen cell virus，BQCV) 引起的一种常见的蜜蜂病毒病，春季和初夏高发，主要危害蜂王的幼虫和蛹，并可导致巢房变黑，进而 引发蜜蜂大量死亡，目前已呈全球性分布。 6 临床诊断 6.1 临床症状 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 动。 6.2 患病蜂王幼虫体色变黄，表皮逐渐硬化呈囊状。 患病蜂蛹体色变暗，快速死亡。 患病蜂王体色先变为灰白色，逐渐再变为黑色，最后王台内壁变成棕色或黑色。 成年蜜蜂主要有尾部变黑，体毛脱落、斑纹混乱、蜜蜂吻拉长，严重时无法飞行而只能爬行移 初步诊断 当蜂群出现以上部分或全部临床症状时，可做出初步诊断，确认需要进行实验室诊断。 7 实验室诊断 7.1 设备、材料和试剂 7.1.1 7.1.1.1 7.1.1.2 7.1.1.3 7.1.1.4 7.1.1.5 7.1.1.6 7.1.1.7 7.1.1.8 7.1.2 7.1.2.1 7.1.2.2 7.1.2.3 7.1.2.4 7.1.2.5 7.1.2.6 7.1.2.7 7.1.2.8 7.1.2.9 2 设备 普通 PCR 扩增仪。 荧光 PCR 仪。 台式冷冻高速离心机。 微量移液器（0.5 µL～10 µL, 2 µL～20 µL, 20 µL～200 µL, 100 µL～1000 µL）。 水平电泳仪。 凝胶成像系统。 电子天平（感量 0.01 g）。 冰箱（2 ℃～8 ℃和–80 ℃）。 材料和试剂 试验用水应符合 GB/T 6682-2008 中一级水的规格要求。 焦炭酸二乙酯处理水（DEPC 水）。 Trizol。 三氯甲烷。 异丙醇。 无水乙醇。 10×One Step RNA PCR Buffer。 MgCl2。 dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。 DB35/T 1761—2018 7.1.2.10 7.1.2.11 7.1.2.12 7.1.2.13 7.1.2.14 7.1.2.15 7.1.2.16 7.1.2.17 7.1.3 逆转录酶。 Taq DNA 聚合酶。 琼脂糖。 分子量标准（100 bp ～1000 bp）。 TBE 电泳缓冲液，配制方法见附录 A 中的 A.1。 EB（10 mg/mL），配制方法见附录 A 中的 A.2. 上样缓冲液，配制方法见附录 A 中的 A.3。 DNA 纯化回收试剂盒。 引物和探针序列 7.1.3.1 普通 RT-PCR 引物序列 F1 5′- TGG TCA GCT CCC ACT ACC TTA AAC -3′； R1 5′- GCA ACA AGA AGA AAC GTA AAC CAC -3′； 扩增片段约701 bp，用ddH2O溶解至10 μmol/L后，保存于-20 ℃备用。 7.1.3.2 荧光 RT-PCR 引物和探针序列 上游引物 F2 5’- TCA CCC CTA ACA ACA ACT ATT CCC -3’； 下游引物 R2 5’- GCT CCC GTC TTA GAG TAA TCC TTC -3’； 探针P序列为 FAM–CGACAGCGTGCCAAAGAGAGTAAGGG –TAMRA； 扩增片段约188 bp，用ddH2O 溶解至10 μmol/L后，保存于-20 ℃备用。 7.1.4 质控物质 7.1.4.1 7.1.4.2 7.1.4.3 7.2 阳性对照为含 BQCV 的阳性组织或含目的片段的 RNA； 阴性对照为未感染 BQCV 的健康蜜蜂组织； 空白对照用水代替样品。 样品采集 据临床诊断结果，选择疑似感染的蜂群，无菌割取一块大小约3 mm×3 mm的带有病、死虫或蛹蜂的 王台；也可无菌挑取单个病、死虫或蛹2～3只装入无菌的小试管内；发现患病蜂王也可采取单个蜂王个 体；对于成蜂样品，也可挑取蜂群内王台上或蜂箱底部带有典型病状的蜜蜂，以及在蜂箱前爬行的垂死 蜜蜂和死亡蜜蜂10～20只。样品保存于2 ℃～8 ℃的条件下，24 h内送实验室检测。 7.3 7.3.1 BQCV 的 RT-PCR 检测 RNA 提取 选取不超过300 mg待鉴定虫体、蜂体或王台，置于DEPC处理过的研钵中，加入液氮进行研磨，将研 磨得到的粉末，快速转移至无RNase并经过液氮冷却的1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol试剂，用移液 器充分吹打10～20次，室温放置5 min；加入200 μL三氯甲烷，旋涡振荡30 s混匀，室温放置15 min； 12 000 r/min离心15 min；取上层水相至一新的离心管中，加等体积异丙醇，上下颠倒数次混匀，-20 ℃ 放置20 min；12 000 r/min离心15 min；弃上清液，沉淀用1 mL 75％乙醇清洗；10 000 r/min离心10 min， 弃上清液，沉淀室温干燥5 min；加20 μL DEPC水溶解RNA沉淀。-80℃冰箱保存备用，RNA溶液应避免 反复冻融，并尽快用于检测。RNA提取也可采用其他等效的提取方法或等效的商品化RNA提取试剂盒，代 替以上方法。 3 DB35/T 1761—2018 7.3.2 RT-PCR 反应 7.3.2.1 反应体系 在0.2 mL PCR