ICS  61.020 Y 76 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2815—2017 羽绒羽毛中沙门氏菌检测方法 酶联免疫法 Method for detection of Salmonella in down and feather : Euzymelinked immunosorbent assay（ELISA） 文稿版次选择 2017 - 03 - 30 发布 安徽省质量技术监督局 2017 - 04 - 30 实施 发 布 DB34/T 2815—2017 前    言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：安徽省检验检疫科学技术研究院。 本标准主要起草人：孙娟娟、陈雪娇、李云飞、宗凯、郑海松、余晓峰。 I DB34/T 2815—2017 羽绒羽毛中沙门氏菌检测方法 酶联免疫法 1 范围 本标准规定了羽绒羽毛中沙门氏菌的酶联免疫检测方法。 本标准适用于各种品种、规格的羽绒羽毛及其制品填充料中沙门氏菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 基本信息 沙门氏菌（salmonella）为革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌，（0.7～1.5 μm）×（2～5 μm）散在， 无荚膜和芽孢，（除鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌外）都具有周身鞭毛，能运动，大多数具有菌毛， 能吸附于宿主细胞表面或凝集豚鼠红细胞。沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般沙门氏菌具有菌体(O) 抗原、鞭毛(H)抗原和表面抗原(荚膜或包膜抗原)三种抗原，目前已知有 2000 多种血清型。 4 方法原理 根据沙门氏菌在选择性培养基上形成的菌落特征，或根据酶联免疫筛选的阳性结果挑出可疑菌落， 依据进一步的生化鉴定以及血清学鉴定的结果，对沙门氏菌进行判定。 5 仪器设备 恒温培养箱、冰箱、干热灭菌箱、高压蒸汽灭菌锅、均质器、振荡器、水浴锅、摇床、电子天平、 硝酸纤维素薄膜（0.45 μm）、抽滤器、无菌锥形瓶、无菌塑料袋无菌吸管 10 ml(具 0.1 ml 刻度)或 微量移液器及吸头、无菌培养皿、无菌试管、pH 计或 pH 试纸、全自动免疫酶标分析仪、全自动微生 物生化鉴定系统。 6 培养基和试剂 缓冲蛋白胨水（BPW）、四磺酸钠黄绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS） 琼脂、木糖蓝氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、 沙门氏菌属显色培养基、沙门氏菌 O 和 H 诊断血清、生化 鉴定试剂条、生化鉴定卡。 实验用水应符合 GB/T 6682 的规定。培养基的配制见附录A。 1 DB34/T 2815—2017 7 检验程序 见图1。 图1 8 羽绒羽毛中沙门氏菌的检验程序 操作步骤 8.1 试样前处理 用无菌镊子和剪刀取出两个各 12 g 样品，称量，精确到 0.1 g，放入烧杯中，每个烧杯加入 1200 ml 0.1％蛋白胨生理盐水，室温下，摇床摇匀（160 rpm）或机械（加玻璃珠）搅拌 3 h，无菌纱布过 滤后混合滤液，取 2000 ml 原始滤液，用过滤器经孔径 0.45μm 滤膜过滤，滤膜取下，放入装有 100 ml BPW 的均质袋中进行前增菌。36℃±1℃培养 18～24 h。 8.2 沙门氏菌分离培养 轻轻摇动培养过的样品前增菌混合液，移取 1 ml，转种于 10 ml TTB 中，于 42℃±1℃培养 18～ 24 h。同时，另取 1 ml，转种于 10ml SC 中，于 36℃±1℃培养 18～24 h。 2 DB34/T 2815—2017 分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个沙门氏菌属显色培养基平板（或 XLD 琼脂平板）。于 36℃±1℃培养 18～24 h（沙门氏菌属显色培养基平板）或 40～48 h（BS 琼脂 平板）。 观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表1。 表1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色； BS 琼脂 有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色； HE 琼脂 有些菌株为黄色，中心黑色或全黑色。 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部 XLD 琼脂 黑色的菌落； 有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。 沙门氏菌属显色培养基 按照显色培养基的说明进行判定。 用 SC 或 TTB 前增菌的混合液，可直接用于全自动免疫酶标分析仪进行初筛，初筛阴性可直接判 定未检出沙门氏菌,初筛阳性须进一步做生化鉴定。 初筛阳性的混合液用接种环划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个沙门氏菌属显色培养基平板（或 XLD 琼脂平板）。操作同上。 8.3 生化鉴定 在选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于 底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36℃±1℃培养 18～24 h，必要时可延长至 48 h。 在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。 表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验 初步判断 斜面 底层 产气 硫化氢 培养基 K A +(－) +(－) + 可疑沙门氏菌属 K A +(－) +(－) － 可疑沙门氏菌属 A A +(－) +(－) + 可疑沙门氏菌属 A A +/－ +/－ － 非沙门氏菌属 K K +/－ +/－ +/－ 非沙门氏菌属 注：K:产碱，A：产酸；+：阳性，－：阴性；+(－)：多数阳性，少数阴性；+/－：阳性或阴性。 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿 素琼脂（pH 7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接 种于 36℃±1℃培养 18～24 h，必要时可延长至 48 h，按表3 判定结果。 将已挑菌落的平板储存于 2℃～5℃或室温至少保留 24 h，以备必要时复查。 3 DB34/T 2815—2017 表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 硫化氢 反应序号 （H2S） 靛基质 pH 7.2 尿素 氰化钾 （KCN） 赖氨酸脱羧酶 A1 ＋ － － － ＋ A2 ＋ ＋ － － ＋ A3 － － － － +/－ 注： +：阳性，－：阴性； +/－：阳性或阴性。 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1 项异常， 按表4 可判定为沙门氏菌。如有 2 项异常为非沙门氏菌。 反应序号 A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需 要结合血清学鉴定结果进行判定。 反应序号 A3：补做 ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌 为赖氨酸脱羧酶阴性。 必要时按表5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。 表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH 7.2 尿素 氰化钾（KCN） 赖氨酸脱羧酶 判定结果 － － － 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果） － ＋ ＋ 沙门氏菌 Ⅳ 或 Ⅴ（要求符合本群生化特性） ＋ － ＋ 沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） 注：+ 表示阳性，－ 表示阴性。 表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别 项目 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ 卫矛醇 ＋ ＋ － － ＋ － 山梨醇 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － 水杨苷 － － － ＋ － － ONPG － － ＋ － ＋ － 丙二酸盐 － ＋ ＋ － － － KVN － － － ＋ ＋ － 注：+ 表示阳性，－ 表示阴性。 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可从沙门显色培养基或 BS 培养基上挑取可 疑菌落，经营养琼脂平板纯化后，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动 微生物生化鉴定系统进行鉴定。全自动生化鉴定系统可直接鉴定出沙门氏菌菌型。 8.4 血清学分型（选做） 8.4.1 抗原的准备 一般采用 1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O 血清不凝集时，将菌株接种在 琼脂量较高的 （如 2％～3％） 培养基上再检查；如果是由于 Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时， 可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌 4 DB34/T 2815—2017 株接种在 0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌 株通过装有 0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管 1 次～2 次，自远端取菌培养后再检查。 8.4.2 O 抗原的鉴定 在玻片上划出 2 个约 1 cm×2 cm 的区域，挑取 1 环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域 上部，在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为 对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对 着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 用 A～F 多价 O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌 株，不能分型。 被 A～F 多价 O 血清凝集者，依次用 O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2 和 O11 因子血清做凝集试 验。根据试验结果，判定 O 群。被 O3、O10 血清凝集的菌株，再用 O10、O15、O34、O19 单因子血清 做凝集试验，判定 E1、E2、E3、E4 各亚群，每一个 O 抗原成分的最后确定均应根据 O 单因子血清的 检查结果，没有 O 单因子血清的要用两个 O 复合因子血清进行核对。 不被 A～F 多价 O 血清凝集者，先用 9 种多价 O 血清检查，