ICS 65.020.30 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3112—2018 猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术 Loop-mediated isothermal amplification for Pseudorabies Virus 2018 - 02 - 02 发布 山东省质量技术监督局 2018 - 03 - 02 实施 发 布 DB37/T 3112—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准起草人：李俊、时建立、彭喆、吴晓燕、张玲玲、郑书轩、徐绍建、孙文博、于江、丛晓燕、 韩红、吴家强、杜以军、陈蕾、陈智、刘畅。 I DB37/T 3112—2018 猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术 1 范围 本标准规定了猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）检测技术的操作步骤。 本标准适用于猪伪狂犬病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 LAMP 环介导等温扩增技术。 3.2 Bst DNA Polymerase 嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶。 3.3 SDS 十二烷基硫酸钠。 3.4 4S Green Plus Nucleic Acid Stain 无毒型核酸染色剂。 4 材料及设备 4.1 主要仪器设备 4.1.1 微量移液器（最大量程分别为 10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL），带滤芯的枪头。 4.1.2 20000 r/min 低温高速离心机。 1 DB37/T 3112—2018 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.1.7 4.1.8 4.1.9 4.1.10 电热恒温水槽。 稳流稳压电泳仪。 水平电泳槽。 凝胶成像系统。 紫外透射反射分析仪。 电磁炉。 烧杯（1000mL）。 电子天平 精度为：0.001g。 4.2 主要试剂或材料 4.2.1 5mol/L Betaine 溶液：配制见附录 A.1。 4.2.2 Bst DNA Polymerase（8U/μL）。 4.2.3 SYBR Green Ⅰ核酸染料。 4.2.4 0.5×TBE 缓冲液：配制见附录 A.2。 4.2.5 2%琼脂糖电泳液：配制见附录 A.3。 4.2.6 4S Green Plus Nucleic Acid Stain。 4.2.7 DNA Marker 2000。 4.2.8 10%SDS 溶液：配制见附录 A.4。 4.2.9 超纯水：符合 GB/T 6682，三级。 4.2.10 引物 猪伪狂犬病毒LAMP检测引物： F3： 5’- ACGAGCCCCGCTTCCA -3’。 B3： 5’- AGATGCAGGGCTCGTACA -3’。 FIP：5’- AGACCACGCGCGCGGCATCAG-CTTCCACTCGCAGCTCTTCT-3’。 BIP：5’- GAGAACTTCACCGCCACGCT-CGTAGTACAGCAGGCACCG-3’。 5 检测步骤 5.1 样品采集与处理 采集血清或淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等脏器。 5.2 样品处理 5.2.1 血清直接用于 DNA 提取。 5.2.2 淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等脏器各 1 g 剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水 1∶ 5 倍稀释，取悬液反复冻融 3 次，5000 r/min 离心 15 min，取上清液-20 ℃保存备用。 5.3 病毒 DNA 的提取 5.3.1 取上清液（或血清）500 μL 加入 10%SDS 溶液 50 μL、20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液 10 μL，于 55 ℃ 水浴 2 h～3 h。 5.3.2 加入 200 μL Tris 饱和酚，混匀，4 ℃ 12000 r/min 离心 15 min。 5.3.3 取上清液 500 μL，加入 200 μL Tris 饱和酚和 200 μL 三氯甲烷，4 ℃ 12000 r/min 离心 15 min。 2 DB37/T 3112—2018 5.3.4 5.3.5 min。 5.3.6 5.3.7 取上清液 400 μL，加入 200 μL 三氯甲烷，4 ℃ 12000 r/min 离心 15 min。 取上清液 300 μL，加入 2 倍体积的无水乙醇，-20 ℃静置 20 min，4 ℃ 12000 r/min 离心 15 弃上清液，加入 1 mL 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。 加入 20 μL 灭菌超纯水溶解沉淀，-20 ℃保存备用。 5.4 环介导等温扩增（LAMP）检测步骤 5.4.1 环介导等温扩增反应体系配制，按表 1 中 1～8 的循序配制。 表1 环介导等温扩增反应体系（25 μL） 体系组成 体系含量 1 10×ThermoPol 2.5 μL 2 dNTP混合液(10 mmol/L) 4.0 μL 3 B3/F3(5 μmol/L) 0.15 μL×2 4 BIP/FIP(50 μmol/L) 1.5 μL×2 5 Betaine(5 mol/L) 3.0 μL 6 DNA 1.0 μL 7 Bst DNA Polymerase(8 U/μL) 1 μL 8 超纯水 10.2 μL 5.4.2 LAMP 程序设定 每次LAMP均应设一个阳性对照和阴性对照，具体参数见表2 表2 LAMP 反应程序设定 温度 时间 1 63 ℃ 60 min 2 80 ℃ 5 min 5.5 电泳 5.5.1 2%琼脂糖凝胶板的制备（见附录 A.3）。 5.5.2 加样 将LAMP扩增产物5 μL与1 μL 6×Loading Buffer混合，点样于1%琼脂糖凝胶孔中，以DNA Marker2000作相对分子质量指示。每次电泳加阳性对照和阴性对照的扩增产物作对照。 5.5.3 电泳 保持稳定电压80 V，电泳20 min，观察结果。 6 结果判定 6.1 电泳结果判定 电泳反应结束后，如果阳性对照孔出现瀑布样条带，阴性对照孔不出现瀑布样条带，则试验成立。 在试验成立条件下，出现瀑布样条带泳道的样品判为阳性（说明样品中含有猪伪狂犬病毒），不出 现瀑布样条带泳道的样品为阴性（参见附录A.5）。 3 DB37/T 3112—2018 6.2 可视化结果判定 6.2.1 LAMP 反应体系中加入 1 μL SYBR Green Ⅰ核酸染料，混匀（加深观察颜色），阳性反应管内 液体变为黄色，阴性反应管不发生颜色变化，为橘红色（参见附录 A.6）。 6.2.2 反应管置于紫外透射反射分析仪下，阳性反应管发出明亮的黄绿色荧光，阴性反应管不显现荧 光（参见附录 A.7）。 4 DB37/T 3112—2018 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 5mol/L Betaine溶液 Betaine 灭菌超纯水 1.4644 g。 2.5 mL。 A.2 0.5×TBE缓冲液 Tris 108 g。 Na2EDTA.2H2O 7.44 g。 硼酸 55 g。 灭菌超纯水 定容至1 L，配成10×TBE缓冲液。 取10×TBE缓冲液25 mL，加灭菌水475 mL，制成0.5倍的工作液。 A.3 2%琼脂糖电泳液 琼脂糖 0.5×TBE缓冲液 1.2 g。 60 mL。 A.4 10%SDS溶液 SDS 灭菌超纯水定容至 1 g。 10 mL。 A.5 LAMP反应电泳检测结果 5 DB37/T 3112—2018 M：DL-2000；1、2、3、5、6：PRV阳性样品；4、7：PRV阴性样品；P：Positive control；N：Negative control。 A.6 LAMP反应肉眼观察的可视化结果 1：Positive control ；2：PRV 阳性反应管；N：Negative control。 A.7 LAMP反应紫外透射反射分析仪下可视化结果 1：Positive control ；2：PRV 阳性反应管；N：Negative control。 _________________________________ 6