ICS 67.050 X 04 DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 45/T 1669—2018 陆川猪肉及其制品的 DNA 分子鉴定方法 DNA molecular identification method of Luchuan pig meat and its products 2018 - 03 - 25 发布 广西壮族自治区质量技术监督局 2018 - 04 - 25 实施 发 布 DB45/T 1669—2018 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 原理 .............................................................................. 2 5 仪器与试剂 ........................................................................ 2 6 鉴定步骤 .......................................................................... 2 7 结果判定与表述 .................................................................... 3 8 实验室防污染措施 .................................................................. 4 附录 A（资料性附录） 陆川猪肉特异性条带的核苷酸序列信息 .............................. 5 附录 B（规范性附录） PCR 所用引物序列 ................................................ 6 附录 C（资料性附录） 样品 DNA 提取方法 ................................................ 7 附录 D（资料性附录） 1.8%琼脂糖凝胶的制备 ............................................ 8 I — DB45/T 1669 2018 II — DB45/T 1669 2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由广西大学提出。 本标准起草单位：广西大学、广西分析测试研究中心、广西经贸职业技术学院、广西陆川县质量技 术监督局。 本标准主要起草人：黄丽、滕建文、杨磊、黄岛平、庞理松、夏宁、林葵、韦保耀、庞丽、李中宇。 III — DB45/T 1669 2018 陆川猪肉及其制品的 DNA 分子鉴定方法 1 范围 本标准规定了陆川猪肉及其制品的DNA分子鉴定的术语和定义、原理、仪器与试剂、鉴定步骤、结 果判定与表述和实验室防污染措施的要求。 本标准适用于广西壮族自治区内陆川猪肉及其制品的DNA分子鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 NY/T 2993 陆川猪 3 术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。 3.1 陆川猪肉 Luchuan pig meat 体。 来源于NY/T 2993中纯种陆川猪生猪，以及以纯种陆川猪为母系进行杂交后的杂元陆川猪生猪的酮 注：杂元陆川猪包括二元杂陆川猪和三元杂陆川猪。 3.2 陆川猪肉制品 meat products of Luchuan pig 以陆川猪肉为原料，经过相应工艺加工制成的扣肉、腊肉、腊肠、猪蹄等肉制品的总称。 3.3 聚合酶链反应 polymerase chain reaction；PCR 由“热变性→复性→延伸”三步反应组成一个循环，经过多次循环反应，使目标DNA得以大量扩增 的一种在体外快速扩增特定基因或DNA片段的方法。 3.4 特异性引物 specific primer 在PCR反应中与模板 DNA 两端分别特异性结合，针对特定模板DNA片段设计的两段与模板两端分别 互补的一对寡核苷酸序列。 4 原理 1 — 利用DNA提取试剂盒，提取样品中的DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，从而对生鲜猪肉及制品的原料属性是否归属陆川猪肉进行判断。特异性条带的核苷酸序列信 息参见附录A。 DB45/T 1669 2018 5 仪器与试剂 5.1 主要仪器及耗材 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 5.1.6 5.1.7 5.1.8 5.1.9 5.1.10 5.1.11 PCR 仪。 电泳仪。 凝胶成像仪。 高速冷冻离心机。 小型离心机（7 000 rpm）。 冷藏冷冻冰箱。 漩涡振荡器。 微量移液器（10 µL、100 µL、1 000 µL）。 0.2 mL 普通 PCR 管。 一次性 PE 手套。 1.5 mL 离心管。 5.2 主要试剂 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.2.7 5.2.8 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或者生化试剂。 实验用水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 DNA 提取试剂盒。 1×TAE 缓冲液。 2×Es PCR Master Mix（含溴酚蓝染料）。 Marker 为 100 bp Plus DNA ladder。 琼脂糖；电泳纯。 嗅化乙锭（EB）。 5.3 特异性引物 根据陆川猪线粒体TYRP1基因的核苷酸序列设计的引物，WM12扩增陆川猪的基因片段大小为1 500 bp，WM14扩增非纯种陆川猪的基因片段大小为800 bp～900 bp 。PCR所用引物序列见附录B，使用前先 对其进行预处理，使用小型离心机对引物进行2 s左右离心，后加入说明书上标注的各引物稀释所需体 积的ddH O，使引物浓度达到10 µM，完成后将引物放入-20 ℃冰箱中保存备用。 2 6 鉴定步骤 6.1 样品 DNA 提取 依照DNA提取试剂盒中DNA提取操作进行提取，方法参照附录C。 6.2 PCR 反应 2 — 在冰浴条件下，按25 µL的PCR反应体系用量在PCR反应管中分别加入各PCR试剂，每个样本做三个平 行，同时PCR扩增阴性对照和空白对照。配置体系时依照表1，最后加入模板DNA。 DB45/T 1669 2018 表1 PCR 反应体系 试剂名称 剂 量 引物（上游） 0.5 µL 引物（下游） 0.5 µL 2× Es Taq Master Mix 12.5 µL 模板 DNA 1.0 µL 补 ddH2O 至 25.0 µL 6.3 PCR 反应程序 95 ℃/5 min预变性；95 ℃/30 s变性，40℃/30 s退火，72 ℃/2 min延伸，35～40个循环；72 ℃/5 min 总延伸；4 ℃/5 min结束扩增。PCR产物直接进行琼脂糖凝胶电泳分析或置于4 ℃保存备用。 6.4 实验对照 阴性对照：将不含陆川猪血缘的猪肉或肉制品按 6.1 提取 DNA，按 6.2 配置 PCR 反应体系，按 6.3 程序进行 PCR 扩增。 6.4.2 空白对照：以灭菌水代替 DNA 模板，按 6.2 配置 PCR 反应体系，按 6.3 程序进行 PCR 扩增。 6.4.1 6.5 琼脂糖电泳检测 PCR扩增完成后，尽快进行琼脂糖电泳检测，使用微量移液器取3 µL扩增产物，加入到浓度为1.8 % 的琼脂糖凝胶（1.8 %琼脂糖凝胶制备参见附录D）的上样孔中，同时加入3.5 µL的Marker，用1×TAE作 为缓冲液，按4 V/cm设定电压，电泳2 h。 6.6 紫外成像拍照 电泳结束后，小心地将凝胶从电泳槽中取出，放入盛有适当浓度溴化乙锭的避光容器里染色15 min 左右，染色完成后将凝胶转移到凝胶成像仪中观察拍照。拍照获得相应的电泳图进行结果判定。若不能 及时进行紫外拍照观察，应将凝胶放入1×TAE缓冲液中暂时保存，但不宜超过4 h，超过应按步骤6.4和 6.5重做。 7 结果判定与表述 7.1 质量控制 以下条件有一条不满足时，结果视为无效： ——空白对照：目标基因琼脂糖电泳检测无条带； ——阴性对照：WM12 目标基因琼脂糖电泳检测无 1 500 bp 对应条带。 7.2 结果判定 3 — 将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪内观察，观察测试样品琼脂糖电泳检测图，按照以下方法进 行判定： ——如测试样品 WM12 目标基因琼脂糖电泳检测有 1 500 bp 对应条带，则被检样品为陆川猪肉及其 制品； ——如测试样品 WM12 目标基因琼脂糖电泳检测无 1 500 bp 对应条带，则被检样品为非陆川猪肉及 其制品； ——如测试样品 WM12 目标基因琼脂糖电泳检测有 1 500 bp 对应条带，WM14 目标基因琼脂糖电泳检 测没有 800 bp～900 bp 对应条带，则被检样品为纯种陆川猪肉及其制品； ——如测试样品 WM12 目标基因琼脂糖电泳检测有 1500 bp 对应条带，WM14 目标基因琼脂糖电泳检 测有 800 bp～900 bp 对应条带，则被检样品为杂元陆川猪肉及其制品。 DB45/T 1669 2018 8 实验室防污染措施 按照GB/T 27403的规定执行。 4 AA — DB45/T 1669 2018 附 录 A （资料性附录） 陆川猪肉特异性条带的核苷酸序列信息 陆川猪肉特异性条带的核苷酸序列信息为： ACAAAGGGCTACAAACCAA