ICS 07.080 A 21 中华人民共和国国家标准 GB/T 40186—2021 微生物诱变育种致遗传物质损伤强度 测定 Umu 法 Determination of genetic material damage strength for microbial mutation breedingUmu method 2021-12-01实施 2021-05-21发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 40186—2021 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草， 本标准由中国标准化研究院提出并归口。 本标准起草单位：清华大学、洛阳华清天木生物科技有限公司、华南理工大学、中国标准化研究院。 本标准主要起草人：张独、邢新会、李梅、剪兴金、王立言、郭肖杰、张乐乐、李爽、马爱进 GB/T 40186—2021 微生物诱变育种致遗传物质损伤强度 测定Umu法 1范围 本标准规定了用生物遗传毒性（umu）测试方法测定微生物诱变育种致遗传物质损伤强度的方法。 本标准适用于利用umu测试法测定诱变育种致微生物遗传物质损伤强度。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 透变 mutagenesis 通过人为的措施诱导遗传物质产生突变 3.2 遗传物质损伤 5genetic material damage 化学或物理诱变源对遗传物质分子结构的改变。 3.3 应急反应 SOsresponse 当细胞发生脱氧核糖核酸（DNA）损伤时，产生的一种应激响应机制 注：在原核生物中主要受应急反应（SOSresponse)系统调控，调控超过40个基因的表达来应对DNA损伤。 3.4 遗传物质损伤强度 strength of genetic material damage 化学或物理诱变源对遗传物质分子结构改变程度的大小。 注：由于当细胞受到DNA损伤时会发生应急修复（SOS修复），使其以突变为代价继续存活下去，常用SOS修复强 弱代表遗传物质损伤强度。 3.5 umu测试法 umutest 一种将编码DNA聚合酶中重要组分的umuC基因与编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因融合，导入 到鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）中，通过检测β-半乳糖苷酶活性来测定SOS的诱导强度 的方法。 注：可用于测定遗传物质损伤强度。 1 GB/T40186—2021 4原理 基于umu测试方法，采用荧光素-2-β-D-半乳糖苷作为β-半乳糖苷酶的荧光底物，利用碘化丙啶作 为死细胞染料，通过采用流式细胞荧光分选技术（FACS）测定诱变后活细胞的β-半乳糖活性，从而 得到活细胞的遗传物质损伤强度。 5试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水为GB/T6682规定的一级水。 5.11mol/L盐酸溶液 量取83.3mL的12mol/L浓盐酸，用水溶解定容至1L，得到浓度为1mol/L的盐酸溶液 5.21mol/L氢氧化钠溶液 称取40.0g氢氧化钠，用水溶解定容至1L。 5.3测试微生物培养基（TGA） 称取胰蛋白陈10.0g，氯化钠5.0g，4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)11.9g，加人980mL水溶解，pH 调整为7.0±0.2，定容到1000mL。121℃，15min高压灭菌。溶解2.0g葡萄糖在20mL去离子水中 青霉素。该溶液可以在一20℃保存4周。 5.4荧光素-2-β-D-吡喃半乳糖苷（Fluoresceindi-β-D-galactopyranoside，FDG）溶液 度为2mmol/L，分装后保存在一20℃冰箱中。使用前在37℃预热15min以上。 5.5碘化丙啶（Propidiumiodide，PI）溶液 在10mLPBS溶液中溶解6.68mgPI，配成浓度为1mmol/L的PI溶液。用移液枪吸取10μL浓 度为1mmol/L的PI储备液，溶于10mLPBS溶液中，配成浓度1μmol/L的PI溶液，作为PI工作液。 于4℃保存，使用前在冰上放置预冷。 6仪器设备 SAC 6.1恒温水浴锅：温度可实现37℃土1℃。 6.2pH计，精度0.1。 6.3电子天平，精度0.01mg。 6.4高速离心机。 6.5流式细胞仪。 6.6恒温震荡摇床，温度可实现37℃±1℃，转速范围满足125r/min~250r/min。 紫外-可见光分光光度计，可检测波长包含600nm土20nm，配备1cm比色皿。 2 GB/T40186—2021 7样品 7.1测试微生物 鼠伤寒沙门氏菌SalmonellatyphimuriumNM2009，包含表达umuC-lacZ基因和氨苄青霉素抗 性基因的质粒（质粒序列参见附录A）。 7.2测试微生物的保存 将150试微测试微生物培养物置于冻存管中，再加入含有10%（体积分数）二甲基亚砜或20%（体 积分数）甘油的水溶液350μL，充分混匀后，保存于一80℃冰箱中。 8试验步骤 8.1测试微生物过夜培养物 测试微生物过夜培养物过程如下： a）在100mL三角摇瓶中装人20mLTGA培养基，用透气瓶塞封口，灭菌储存； b) 室温融化冻存的测试微生物，然后在冻存管中加人1mLTGA培养基； c) 以4000r/min转速离心冻存管中的测试微生物10min，然后丢弃上清液，用1mLTGA培养 基重悬测试菌； (P 用0.5mL测试微生物重悬液接种到含TGA培养基的三角瓶中，在37℃土1℃的恒温摇床中 震荡培养过夜（不超过12h）。 8.2准备测试微生物诱变样品和对照样品 培养，并设定检测波长为600nm土20nm，以TGA培养基作为空白对照，用1cm比色皿检测培养后测 试微生物样品应处于对数生长期。 通过物理诱变或化学诱变等方法对测试微生物样品进行诱变处理得到诱变组，通过不进行诱变处 理得到对照组。测试微生物诱变样品的量宜在200uL以上，将诱变处理后的实验组和对照组转移到 1.5mL离心管中，在37℃±1℃震荡培养箱中200r/min培养2h。 8.3FDG和PI染色 取诱变组和对照组测试样品50μL置于1.5mL的离心管中，在37℃预热5min后，加人37℃预 热的FDG溶液50μL，迅速温和混匀后，置于37℃水浴中2min，使FDG渗透进入细胞。 再向上述1.5mL离心管中迅速加入500μL的PI溶液，将混合液放置于冰上反应1h，在进行流式 细胞测定前应一直将其置于冰上。 8.4流式细胞仪测定 采用流式细胞仪对染色后样品进行流式分析。设定激发波长为488nm，对于FDG水解产物荧光 素的荧光强度测定接收波长为525nm（FL-1通道），PI染色荧光测定接收波长为670nm（FL-2通道）。 设定测定细胞总数为5000~10000。 8.5阅值的设定 通过前向角散射光FSC和侧向角散射光SSC圈出目标菌体，以去除多细胞粘连对结果的影响。 3 GB/T40186—2021 通过单独的PI染色，测定FL-1通道和FL-2通道的相对荧光值，在FL-1坐标轴上圈出PI染色细 胞，圈中细胞的FL-1通道相对荧光值存在一个范围，FL-1相对荧光值不小于这个范围的细胞为PI染 色阴性细胞。 通过单独的FDG染色，测定FL-1通道和FL-2通道的相对荧光值，在FL-2坐标轴上圈出FDG染 色细胞，圈中细胞的FL-2通道相对荧光值存在一个范围,FL-2相对荧光值在此范围内的细胞为FDG 染色阳性细胞。 对于FDG和PI同时染色的样品，选取FDG染色阳性和PI染色阴性的细胞为目标细胞群，用于后 续的数据处理和结果分析。 9 试验数据处理 SOS诱导系数按式(1)计算： Am F: +........( 1) Amc 式中： F$ SOS诱导系数； Am一诱变源处理样品的平均FDG水解产物荧光素相对荧光值； Amc一对照样品的平均FDG水解产物荧光素相对荧光值。 以两个平行样品测定结果的算术平均值报告结果，结果保留至小数点后一位 4 GB/T40186—2021 附录A （资料性附录） 质粒序列信息 鼠伤寒沙门氏菌SalmonellatyphimuriumNM2009，包含表达umuC-lacZ基因和氨苄青霉素抗 性基因的质粒序列信息如下： gacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggt tgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggc aaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagagg 5