ICS 67.050 X 04 GR 中华人民共和国国家标准 GB/T 22948—2008 蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of trimethoprim residues in royal jelly- LC-MS-MS method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 22948—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局 本标准主要起草人：曹彦忠、贾光群、张进杰、石玉秋、王占英、庞国芳。 GB/T22948—2008 蜂王浆中三甲氧苄氨啶残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了蜂王浆中三甲氧芋氨啶残留量液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于蜂王浆中三甲氧芋氨嘧啶残留量的测定。 本标准的方法检出限为2.0μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.12004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994,IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008,ISO3696：1987,MOD） 3原理 蜂王浆中残留的三甲氧苄氨嘧啶用去离子水提取，三氯乙酸沉淀蛋白，离心后，上清液经Oasis MCX离子交换柱或相当的固相萃取柱净化，用氨水-甲醇洗脱并蒸干，残渣用乙睛-0.1%甲酸水溶液 溶解。样品溶液供液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 4.1水:GB/T 6682,一级。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3乙腈：色谱纯。 4.4 三氯乙酸：优级纯。 4.5 甲酸：优级纯。 4.6 氨水：分析纯。 4.7 三氯乙酸溶液：50%（质量分数）。20g三氯乙酸（4.4）溶于20mL水中。 4.8 2%甲酸溶液：吸取2mL甲酸（4.5）用水稀释至100mL。 4.90.1%甲酸溶液：吸取1mL甲酸（4.5)用水稀释至1000mL。 4.10流动相：乙睛-0.1%甲酸溶液（7+13）。 4. 11 氨水-甲醇溶液（1十19）：5mL氨水（4.6）与95mL甲醇（4.2）混合均匀。 4.12三甲氧苄氨嘧啶标准物质（CAS：738-70-5）：纯度≥99%。 4.13 0.1mg/mL标准储备溶液：准确称取适量的标准物质（4.12），用甲醇配成0.1mg/mL的标准储 1）OasisMCX离子交换柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 1 GB/T22948—2008 备溶液，该溶液在4℃保存。 4.14标准工作溶液：吸取0.1mL标准储备溶液（4.13），移至10mL容量瓶中，用甲醇配成1.0μug/ml 的标准工作溶液。该标准工作溶液在4℃保存。 4.15OasisMCX柱或相当者：150mg，6mL。用前依次用5mL甲醇和10mL水活化。保持柱体 湿润。 4.16滤膜：0.2μm。 5仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2液体混匀器。 5.3振荡器。 5.4氮气浓缩仪。 5.5分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.6真空泵：真空度应达到80kPa。 5.7 聚丙烯离心管：50mL。 5.8移液器:0.1mL,1mL。 5.9玻璃贮液器：50ml。 5.10浓缩管：10mL。 6试样制备与保存 6.1试样的制备 对于冷冻的实验室样品，待其解冻后将其搅拌均匀。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样 品瓶中，密封，并做上标记。 6.2试样的保存 将试样于一18℃冷冻保存。 7测定步骤 7.1提取 称取2g试样，精确至0.01g。置于50mL具塞的聚内烯离心管中，加入20mL水，于液体混匀器 （5.2）上快速混匀1min，再置于振荡器（5.3）上振荡提取10min，加入50%三氯乙酸溶液0.5ml，快速 摇动0.5min，以3000r/min离心5min，移取上清液至另一离心管中，再向残渣中加人15mL水，重 复上述步骤，合并上清液。 7.2净化 将塞有玻璃棉塞的玻璃贮液器（5.9）连到OasisMCX柱（4.15）上，将上清液（7.1)倒人玻璃贮液器 （5.9)中，使样液以小于3mL/min的流速通过OasisMCX柱，待样液完全流出后，分别用5mL甲酸溶 液（4.8）和5mL甲醇（4.2）洗柱，弃去全部流出液。最后用5mL氨水-甲醇溶液（4.11）洗脱，收集洗脱 （4.10）溶解残渣，样液过0.2μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定， 7.3基质标准工作溶液的制备 称取4份阴性样品各2g，精确至0.01g。置于50mL具塞的聚丙烯管中，分别加人4μL、10μL、 20μL、40μL、100μL标准工作溶液（4.14），按7.1和7.2步骤操作。制备成浓度为2.0ng/mL、 2 GB/T22948—2008 5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL的基质标准工作溶液。 7.4测定条件 7.4.1液相色谱参考条件 a) 色谱柱：Atlantis，3μm，150mmX2.1mm(内径）或相当者； b) 流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液（7+13）； c) 流速：0.2mL/min;； 柱温：35℃； e) 进样量：20μL。 7. 4. 2 质谱参考条件 a) 离子源：电喷雾离子源； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测； d) 电喷雾电压：5500V； e) 雾化气压力：0.076MPa； 气帘气压力：0.069MPa； g) 辅助气流速：7L/min； h) 离子源温度：450℃； i) 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表1。 表1三甲氧苄氨嘧啶的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压 中文名称 英文名称 定性离子对（m/2）定量离子对（m/z） 碰撞气能量/V 去簇电压/V 291/230 291/230 35 50 三甲氧芋氨嘧啶 trimethoprim 291/123 40 50 291/275 35 50 7.5液相色谱-串联质谱测定 7.5.1定性测定 将被测组分分别选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留 时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在土2.5%之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接 近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定样品中 存在对应的待测物。 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示 相对离子丰度K K>50 20<K<50 10<K<20 K≤10 允许最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 7.5.2定量测定 用基质标准工作溶液（7.3)分别进样，以标准峰面积为纵坐标，以标准添加浓度（ng/mL）为横坐标， 绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中三甲氧苄氨啶的响应值均应在仪器 测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，三甲氧苄氨啶的参考保留时间为2.39min。三 甲氧苄氨嘧啶的标准物质多反应监测（MRM)色谱图参见附录A中的图A.1。 本方法的添加平均回收率数据参见附录B中的表B.1。 7.6平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。 7.7空白试验 除不称取样品外，均按上述步骤进行。 SZC 3