ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 19438.4—2004 H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of avian influenza virus subtype H9 2004-02-15实施 2004-02-14发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19438.4—2004 前言 GB/119438-2004 《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分： GB/T19438.1—2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》； GB/T19438.2—2004 《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》； —GB/T19438.3—2004《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》； GB/T19438.4—2004 《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。 本部分的附录A是资料性附录。 本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。 本部分主要起草人：张利峰、张鹤晓、刘继红、郭晋优、刘艳华、杨伟。 GB/T19438.4—2004 H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法 1范围 本部分规定了荧光RT-PCR检测H9亚型禽流感病毒的操作方法。 本部分适用于活禽及其产品中H9亚型禽流感病毒的检测。 SAC 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。 GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 3缩略语 下列缩略语适用于本部分。 3. 1 荧光RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。 3.2 Ct 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3.3 RNA 核糖核酸。 3. 4 DEPC 焦碳酸乙二酯。 3.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水。 3. 6 bDL Taq DNA 聚合酶。 4原理 H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法是采用TaqMan技术。设计一对仅在H9亚型禽流感 病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的5端和3端分别标记 不同的荧光素，如5'端标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用R 表示），3'端一般标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5'端报告荧光基团发出的荧光信号，称为 淬灭荧光基团（用Q表示）。 当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发 1 GB/T19438.4—2004 出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；当PCR反应进行到延伸阶段时， Tαq酶在引物的引导下，以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链；当链的延伸 进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5→3外切核酸酶的功 能，将探针切成单核苷酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再不 于溶液中，仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。 5材料与试剂 5.1试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水 处理后高压灭菌）分装。 5.1.1三氯甲烷。 5.1.2异丙醇（一20℃预冷）。 5.1.3PBS：配方见GB/T19438.1一2004中附录A。121C土2℃，15min高压灭菌冷却后，无菌条件 下加人青霉素、链霉素各10000IU/mL。 5.1.475%乙醇：用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制，一20℃预冷。 5.1.5H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒"：组成、说明及使用注意事项参见附录A。 5.2仪器与器材 5.2.1荧光RT-PCR检测仪。 5.2.2高速台式冷冻离心机（最高转速12000r/min以上）。 5.2.3台式离心机（最高转速2000r/min）。 5.2.4混匀器。 5.2.5冰箱（2℃～8℃和一20℃两种）。 5.2.6可移动紫外灯。 5.2.7微量可调移液器及配套带滤芯吸头（10μL、100μuL、1000μL）。 5.2.8专用毛细玻璃管或PCR管。 5.2.9Eppendorf管(1.5mL)。 6抽样 6.1采样工具 下列采样工具必须经121℃土2℃，15min高压灭菌并烘干： 棉拭子； 一剪刀、镊子； —注射器； 1.5mLEppendorf管; 一研钵。 6.2样品采集 6.2.1活禽 取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下： 取咽喉子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮3次～5次取咽喉分泌液； 1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果，则可使用这些等效产品 2 GB/T19438.4—2004 一一取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔转一圈并沾取少量粪便； 加盖、编号。 6.2.2肌肉或组织脏器 待检样品装人一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。 6.2.3血清、血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。 6.3样品储运 样品采集后，将采集的样品放入密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放一个塑料袋），于保温箱中 加冰、密封，送实验室。 6.4样品制备 6.4.1咽喉、泄殖腔拭子 样品在混匀器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转 人无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。 6.4.2肌肉或组织脏器 离心15min，取上清液转入无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。 6.5样本存放 样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应放在一70℃以下冰箱，但应避免反复 冻融（冻融不超过3次）。 7操作方法 7.1实验室的设置与管理 实验室的设置与管理见GB/T19438.1一2004中附录C。 7.2样本的处理 在样本制备区进行。 7.2.1取n个灭菌的1.5mLEppendorf管，其中n为被检样品、阳性样品与阴性样品的和（阳性样品、 阴性样品在试剂盒中已标出），做标记。 7.2.2每管加人600μL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL，一份样本换用一 个吸头，再加人200L三氯甲烷，混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手 颠倒混匀）。于4℃、12000r/min离心15min。 7.2.3取与7.2.1相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，加人500μL异丙醇（20℃预冷），做标记。 吸取7.2.2各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μL，不能吸出中间层，颠倒 混匀。 7.2.4于4C、12000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上 洗涤。 7.2.5于4℃、12000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上 清液，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。 7.2.64oo0r/min离心10s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩 到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀 面，室温干燥3min，不能过于干燥，以免RNA不溶。