ICS 65.020.30 B 40 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T25168—2010 畜禽cDNA文库构建与保存技术规程 Technical regulation of farm animals cDNA library construction and preservation 2010-09-26发布 2011-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T25168—2010 前言 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 本标准主要起草人：马月辉、关伟军、陆涛峰、李向臣、佟春玲、余露露、刘鹏 1 GB/T25168—2010 畜禽cDNA文库构建与保存技术规程 1范围 本标准规定了畜禽cDNA文库构建方法。 本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽cDNA文库构建与保存。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 cDNAcomplementarydeoxyribonucleic acid 以成熟mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成的cDNA链。 3.2 cDNA文库cDNAlibrary 将处于特定发育阶段真核生物体的特定器官或组织中提取的总RNA，经过反转录等一系列的生化 3.3 寡核苷酸oligonucleotide 一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称，常用作探针确定DNA或RNA的结构。 3. 4 噬菌斑plaque 被噬菌体感染的细菌所释放的子代噬菌体，会继续感染周围的细胞，致使在琼脂平板上生长的菌苔 中有大量的细胞发生裂解，形成的透明区域。 4试剂及溶液配制 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682一级用水的要求。 4.1焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC)处理水 在1000mL去离子水中加人1mLDEPC，37℃静置12h，高压灭菌（120℃30min）。 4.2 2 mol/L MgSO4 称取246.50gMgSO4·HO，加400mL双蒸水（doubledistilledH,O,ddH,O)溶解后，定容到 500mL，高压灭菌。 4.310 mmol/L MgSO4 量取1mL2mol/LMgSO4加ddH,O定容到200mL，高压灭菌，30min。 4. 41 mol/L Tris-CI(pH7. 5) 称取121.14gTris，碱溶于800mLddH,O中，调pH至7.5，定容到1L，高压灭菌。 4.5SM缓冲液 1 GB/T25168—2010 量浓度）明胶，定容到1L，高压灭菌。 4.65×一链缓冲液 250mmol/LTris(pH8.3),30mmol/LMgCl,375 mmol/LKCl。 4.710×DNA连接酶缓冲液 500mmol/LTris-Cl(pH7.8)，100mmol/LMgCl2，100mmol/L二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT),0.5 mg/mL 牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)。 4.8LB液体培养基 解后，高压灭菌。 4.9LB固体培养基 养用琼脂加1LddH,O溶解后，高压灭菌。 4.10LB顶层培养基 将0.70g琼脂糖加入100mLLB液体培养基中，高压灭菌。 4.1120%麦芽糖 取20.00g麦芽糖溶于100mLddHz0中，过滤除菌。 5主要仪器、设备 水浴锅、电泳仪、电泳槽、电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、培养箱、PCR扩增仪、超纯水仪、一80℃ 低温冰箱、凝胶自动成像分析系统和低温离心机等。 6cDNA文库构建 6.1样品采集 畜禽机体的组织可作为构建cDNA文库的实验材料。将新鲜离体的组织样品迅速投放到液氮中， 或剪切成1mm大小的组织碎块后放入RNA保存液中。 6.2总RNA提取 使用TRIzol法提取畜禽组织的总RNA。在不断填充液氮的研钵中将30mg～100mg的组织样 品磨碎，加入1mLTrizol（含有酚、异硫氰酸胍、8-羟基喹啉和β-巯基乙醇的单相液），混匀后移至经 DEPC处理水浸泡过的离心管中，静置5min。加人200μL三氯甲烷，混匀，静置2min～3min，4℃ 13200g离心10min。弃上清，用DEPC处理水配制的75%乙醇洗涤沉淀2次，室温静置5min~ 0.3g，DEPC处理水21.6mL,10×Mops3mL，37%甲醛5.4mL，核酸显示剂2μL~3μL)检测RNA 质量，于一80℃冰箱中保存。 6. 3 cDNA 合成 SZC 6.3.1cDNA第一链合成 采用5'末端RNA转录子转换机制（switchingmechanismat5'endoftheRNAtranscript， SMART)技术合成全长cDNA双链。首先取一PCR管分别加人0.05μg～1.0μg总RNA样品、 引物，添加DEPC处理水使总体积达到5.0μL，混勾，72℃下放置2min，冰浴2min。然后，分别加人 2.0μL5X一链缓冲液、1.0μL20mmol/LDTT、1.0μL10mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribo nucleosidetriphosphate，dNTP）和1.0μL2ooU/μLPrimerscripiM反转录酶，混匀，42C下放置1h， 冰浴2min终止反应后进行下一步操作或一20℃下短期保存。 6.3.2cDNA第二链的合成 取一PCR管分别加人2.0μL一链cDNA、80μLddH2O、10μL10×Extaq缓冲液、2.0μL 2 GB/T25168—2010 2.5mmol/L50×dNTP、2.0μL10μmol/L5引物、2.0μL10μmol/L经过修饰的Oligo(dT)3'引物 和2.0μL5U/μLExtaq酶，总体积为100μL，混匀，95℃预变性25s后，95℃变性25s，68℃退火延 伸6min，共21个循环。用1.1%琼脂糖对5.0μLPCR产物进行电泳检测，双链cDNA的分布范围在 0.1kb～4.0kb之间。 引物序列为： 5°引物序列5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3 3°引物序列5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-,N-3" (N=A,G,C或 T;N-1= A,G或C) 6.4cDNA的纯化、酶切与分离 6.4.1cDNA的纯化 取一PCR管分别加人50μL2.0μg～3.0μg双链cDNA、2.0μL20μg/μL蛋白酶K，混匀，45℃ 离心5min。移上清至另一离心管中，加人100μL三氯甲烷-异戊醇（24：1），混勾，13200g离心5min。 移上清至另一离心管中，分别加人10μL3mol/L乙酸钠（pH4.8）、1.3μL20μg/μL肝糖元、260μL 95%乙醇，13200g离心20min。弃上清，用100μL80%乙醇洗涤沉淀后干燥10min，然后加人79μL ddH,O溶解沉淀。 6.4.2cDNA的酶切 取一PCR管分别加人79μL双链cDNA、10μL10XSfiI缓冲液、10μL20U/μLSfiI内切酶和 1.0μL100×BSA，总体积为100μL，混勾，50℃下放置2h。加2.0μL1%的二甲苯胺指示剂，混匀。 6.4.3cDNA的分离 重悬分离柱内容物，自然滴尽柱中溶剂，加入700μL柱缓冲液，滴尽。加人100μL酶切产物，滴 尽。加入100μL柱缓冲液，滴尽。加人600μL柱缓冲液，用16支离心管分别逐滴收集，每管一滴。每 管取3.0μL样品，用1.1%琼脂糖凝胶进行片段大小检测。收集300bp以上的cDNA片段于一离心 管中，分别加人1/10体积3mol/L乙酸钠（pH4.8）、1.3μL20mg/mL肝糖元和2.5体积95%乙醇， 混勾，一20℃下沉淀12h。4℃下，13200g离心20min，弃上清，干燥10min，7.0μLddH,0溶解沉 淀，混匀，一20℃保存。 6.5cDNA片段与载体的连接 取一PCR管分别加人100ng的cDNA、1.0μL500ng/μL入TriplEx2载体、0.5μL10×DNA连 接缓冲液、0.5μL10mmol/L三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP)、0.5μL400U/μLT4DNA 连接酶，加ddHzO使总体积达到5.0μL，混匀，16℃下连接12h。 6.6cDNA重组体的包装 解冻包装蛋白抽提物，取10μL，加人4.0μL连接产物，混匀，22℃下包装2h后加入500μLSM 缓冲液和20μL三氯甲烷，混匀。进行未扩增文库滴度测定或4℃保存。 7文库的扩增与保存 在含10mmol/LMgSO4、终浓度为0.2%麦芽糖的LB液体培养基中培养VCS257菌，使细菌ODgo值 为2.0,1000g离心10min，然后用10mmol/LMgSO4重悬细胞，调ODsm值至4.0。分别在20个离心管 中加人500μL的菌液和足够形成6.0×10+个～7.0×104个