ICS 65.020.30 B 40 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T25170—2010 畜禽基因组BAC文库构建与 保存技术规程 Technical regulation of farm animals genome BAC library construction and preservation 2010-09-26发布 2011-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T25170—2010 前言 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口。 本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 本标准主要起草人：关伟军、马月辉、刘长青、潘春留、刘洪坤、甫亚斌、余露露。 1 GB/T25170—2010 畜禽基因组BAC文库构建与 保存技术规程 1范围 本标准规定了畜禽基因组BAC文库构建方法。 本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽的基因组BAC文库构建与保存 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 基因组文库 genome library 用重组DNA技术将某种生物细胞的核DNA的全部片段随机地连接到载体上，冉转移至适当的宿 主细胞中，通过细胞增殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集 3.2 细菌人工染色体bacterialartificialchromosome，BAC 以大肠杆菌致育因子为基础，利用现代重组DNA技术体外人工合成的具有容纳高分子量外源 DNA的特性载体。 3.3 DNA连接DNAligation 键的过程。 3. 4 感受态细胞competentcells 在特定条件下细胞膜通透性发生改变，允许外源DNA进人细胞内的特殊状态下的受体细胞 3.5 电转化electrotransformation 在高压脉冲的作用下，将外源DNA导人感受态细胞的过程。 3. 6 脉冲场凝胶电泳 Kpulsefieldgel electrophoresis,PFGE 3.7 重组体 recombinant 两种以上不同来源的DNA片段连接所形成的杂种DNA分子。 1 GB/T25170—2010 4试剂及溶液配制 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水要符合GB/T6682中一级水的要求。 4.1LB培养冻存缓冲液（luria-bertanimedia） 360mmol/LK,HPO4,13.2mmol/LKH,PO,1.7mmol/L柠檬酸钠,0.4mmol/LMgSO4 6.8mmol/L（NH,),SO，4.4%甘油，定容至100mL,应用时以冻存缓冲液与LB液体培养基1：9的 比例配制。 4.25-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷贮存液（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，X-gal） 用二甲基甲酰胺溶解X-gal，配成20mg/mL贮存液，一20℃避光保存。 4. 31 mol/L Tris-CI 121.10g/LTris碱溶于800mL/L双蒸水（doubledistilledH,O，ddH,O)中，用HCl调pH至 8.0，定容至1000mL，高压灭菌。 4.4内切酶缓冲液 10mg/mLBSA,1o×酶反应缓冲液,1mmol/LDTT,1mmol/L亚精胺。 4.5SOC培养基 称取20.00g胰化蛋白陈，5.00g酵母提取物，0.50gNaCl量取2.5mL1mol/LKCl,10ml 葡萄糖溶液。 4.6异丙基硫代-β-D-半乳糖苷溶液（isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG) 称取1.00gIPTG溶于5.0mL双蒸水中，过滤除菌装成1mL/份，贴存于一20℃C。 4.7琼脂糖块储存液 800mLddHO中加人186.10g乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)，在 磁力搅拌器上搅拌，调pH至8.0后，加ddHO定容至1000mL，高压灭菌。 4.8CsCI密度梯度离心纯化液 3.3mL饱和CsCl,加灭菌石蜡油至总体积10mL。 4.9十二烷基肌氨酸钠缓冲液（N-Dodecanoyl-N-methylglycine sodiumsalt,NDS） 称取186.00gEDTA和1.20gTris-Cl,溶于700mLddH,O中，调pH至8.0,加入NDS调pH 至9.5，用ddH,0定容至1L，过滤灭菌。 4.10抗凝剂（柠檬酸钠葡萄糖液） 称取0.48g柠檬酸、1.32g柠檬酸钠、1.47g葡萄糖，用ddHz0定容至100mL，高压灭菌。 4.11氯霉素 乙醇配制，工作浓度为12.5μg/mL，一20℃保存。 4.12Tris(10mmol/LpH8.0)-EDTA(1.0mmol/LpH8.0)缓冲液,TE 10mmol/LpH8.0Tris-Cl,1.0mmol/LpH8.0EDTA,高压灭菌，室温保存。 4.13LB液体培养基 称取10.00g细菌培养用胰蛋白陈、5.00g细菌培养用酵母提取物、10.00gNaCl溶于800ml ddHO中，调pH至7.4，定容至1L，高压灭菌。 4.14LB固体培养基 称取10.00g细菌培养用胰蛋白陈、5.00g细菌培养用酵母提取物、10.00gNaCl,溶于800mL ddH,O中，调pH至7.4,加人15.00g细胞培养用琼脂，定容至1L，高压灭菌。 4.15含特定抗生素培养基 按照4.14的方法配制好LB固体培养基，高压灭菌后待其不烫手时，按2mL培养基：1L氯霉 素（12.5μg/mL）的比例添加氯霉素，倒20mL培养基于90mm培养板中。待培养基凝固后，将40μL 2 SZG GB/T25170—2010 X-gal和7μuLIPTG混匀后，均匀涂于培养基表面，超净台里晾干备用。 4.16碱裂解液I 50mmol/L葡萄糖，25mmol/LpH8.0Tris-Cl,10mmol/LpH8.0EDTA，定容至1L，高压灭菌， 4℃保存。 4.17碱裂解液Ⅱ 0.2 mol/L NaOH,1% SDS,现用现配。 4.18碱裂解液Ⅲ 1.32mol/L乙酸甲，4℃保存。 5主要仪器、设备 水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱、培养箱、电子天平、一80℃低温冰箱、超纯水仪、低温离心机、凝胶 自动成像分析系统和脉冲电泳仪等。 6基因组BAC文库构建 6.1高分子量DNA制备 6.1.1细胞收集 6.1.1.1家禽血细胞的收集 采集3.0mL～5.0mL畜禽新鲜血液，立即注人含1mL肝素钠（500U/mL)或柠檬酸钠葡萄糖的 离心管中抗凝。4℃下，4500g离心5min，弃上清，加入等体积预冷的pH7.0磷酸盐缓冲液 (phosphatebufferedsaline，PBS），混匀。上述血细胞收集步骤重复离心3次后，加人1.0mLPBS重悬 细胞。重悬细胞后计数，将血细胞密度稀释到1.0X10°个/mL~2.5X108个/mL。 6.1.1.2家畜血细胞的收集 采集10mL～20mL家畜新鲜血液，加入等体积红细胞裂解液，37℃下放置1h，4℃下，583g离心 5min，其余步骤同6.1.1.1。 6.1.1.3畜禽其他组织细胞收集 在干冰或液氮存在的条件下，将新鲜的畜禽组织碾成粉未，悬浮在PBS中，振荡混匀，用两层纱布 过滤。其余步骤同6.1.1.1。 6.1.2细胞裂解 取细胞密度为1.0×10°个/mL~2.5×108个/mL的悬液和1%低熔点琼脂糖在45℃下放置5min 30min形成凝胶块。将凝胶块置于含有0.1mg/mL蛋白酶K和30mL1%NDS缓冲液中50℃下水浴 3h后更换相同缓冲液，再50℃水浴24h~28h。用30mLTE缓冲液（pH7.6)在30min内洗涤3次（冰 上操作）以去除TE缓冲液，置于1.0mmol/L苯甲基磺氟（phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF)中， 50℃下水浴30min，中间换液一次。将凝胶块储存于0.5mol/LEDTA（pH8.0)中4℃可保存半年。 6. 1. 3基因组 DNA 酶切与回收 将凝胶块在4℃下用30mLTE缓冲液浸泡3h～4h中间换液3次4次。置于1mL的适宜限 制性内切酶缓冲液中,冰浴1h，中间换液1次。分别移至不同酶量(1U～20U)的酶切缓冲液中，冰上 渗透1h后，37℃下酶切10min~30min，用1/10体积0.5mol/LEDTA（pH8.0）终止反应。将不完 全消化的DNA凝胶块在0.5XTBE中，13℃，180V~120V.120角，脉冲时间60s~10s条件下进行 PFGE电泳，电泳时间16h~24h。 6.1.4最适DNA片段获得 6.1.4.1第一次电泳选择 用1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切获得的大分子量DNA，电泳条件同6.1.3，电泳时间24h。电泳结 3