ICS 11.100 50 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T30224—2013 刚地弓形虫试验临床应用 Clinical use of tests for Toxoplasma gondii 2013-12-31发布 2014-12-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T30224—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位：北京大学人民医院、首都医科大学友谊医院、首都医科大学附属北京朝阳医院， 本标准主要起草人：张正、岳志红、赵晓涛、苏建荣、许淑珍、王清涛。 I GB/T30224—2013 刚地弓形虫试验临床应用 1范围 本标准规定了刚地弓形虫临床实验室检验方法、标本的采集和处理、安全预防措施和免疫诊断试验 的临床应用。 本标准适用于开展刚地弓形虫检测的临床实验室。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 实验室生物安全手册（第三版）世界卫生组织2004年 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 刚地弓形虫Toxoplasmagondii 弓形虫是法国Nicolle和Manceaux（19o8年）首先从非洲刚地梳趾鼠（Ctenodactylusgondii）体内 单核细胞发现的，由于该虫的滋养体似弓形或半月形，故命名为刚地弓形虫。 3.2 弓形虫病 toxoplasmosis 4检验方法 4.1刚地弓形虫病原学检查 4.1.1直接镜检 用于直接观察寄生虫的标本包括分泌物、排泄物、体液和组织。液体标本应2000r/min离心10min， 取沉淀制成显微镜涂片。经干燥、固定和Giemsa法染色后镜检，以发现速殖子、变性虫体。组织印片 Giemsa法染色可检测到刚地弓形虫包囊，也可以检测到假包囊或速殖子。在少数情况下，确诊弓形虫 病依据病原学检查。 4.1.2接种和组织培养 将患者组织或体液接种于小鼠或组织培养细胞获得虫体或进行被接种动物的血清学检测。 4.1.3抗原检测-酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA） 血清或体液中的循环抗原比特异性抗体出现早，是病原体存在的确证。可使用ELISA双抗体夹心 1 GB/T30224—2013 法检测。 4.1.4核酸检测 为确定是否感染，可应用PCR技术检测虫体DNA。靶基因从B1基因和AF146527序列等选取。 血液、尿液、脑脊液、羊水、眼部体液和支气管灌洗液刚地弓形虫DNA检测阳性是活动性感染的有力证 据，但虫体DNA阴性并不能排除弓形虫病。 4.2刚地弓形虫抗体检测 4.2.1概述 血清学检测刚地弓形虫抗体是目前临床实验室主要的诊断方法。通常，不能根据一种抗体做出确 诊，需进行多种抗体联合检测。如果患者妊娠期采集的两份标本发生血清学从阴性到阳性的转变，可以 作为确诊依据。刚地弓形虫抗体检测方法中详细注意事项参见附录A。 4.2.2刚地弓形虫IgG抗体检测 4.2.2.1IgG抗体-Sabin-Feldman染色试验（Sabin-Feldmandyetest,DT) DT是标准试验。将患者血清与刚地弓形虫速殖子活体、辅助因子和甲基兰染液共同孵育。如果 患者体内有刚地弓形虫抗体，虫体的细胞壁溶解，不能吸收染液。DT检测的早期IgG抗体通常出现于 感染1周～2周，6周～8周滴度达到高峰。此试验敏感性和特异性高，由于活的虫体培养有一定的难 度，对实验室生物安全防护有较高要求，因此临床实验室多用其他方法替代DT。 4.2.2.2IgG抗体-间接血凝试验（indirecthemaggiutinationtest,IHA） IHA试验是将患者血清和经酸处理的可溶性虫体抗原致敏红细胞共同孵育。如果患者体内有 刚地弓形虫抗体，红细胞将凝集。IHA试验适于大量血清标本流行病学调查检测，缺点是红细胞质量 和抗原的变化较难控制。但是，IHA检测的抗体迟于DT出现，不适于患者早期诊断。 4.2.2.3IgG抗体-凝集试验 直接凝集（directagglutination，DA）：血清经2-巯基乙醇处理，与经甲醛处理后的速殖子孵育。如 果患者体内有刚地弓形虫抗体，虫体发生凝集。DA试验操作简便、无种属特异性。 乳胶凝集（latexagglutination，LA）：未经前处理的患者血清与抗原致敏的乳胶颗粒反应。如果有 刚地弓形虫抗体，则发生凝集。LA试验操作简便价廉，可用于刚地弓形虫IgG抗体筛查。由于非特异 性IgM反应，可出现少量假阳性。 鉴别凝集（differentialagglutination，AC/HS）：比较丙酮处理（AC)速殖子和甲醛处理（HS）速殖子 的凝集反应有助于区别急性和慢性感染。急性感染惠者血清标本可使AC和HS虫体悬液均凝集：慢 性感染患者血清标本HS高滴度凝集，AC低滴度凝集或阴性。 4.2.2.4IgG抗体-间接荧光抗体试验（indirectfluorescentantibodytestIFA） IFA试验采用甲醛固定完整速殖子涂片，经空气干燥作为抗原。患者血清与抗原涂片孵育，加人荧 光素标记抗人免疫球蛋白抗体。IFA已替代DT广泛应用。抗核抗体阳性患者可出现假阳性反应。对 于每周筛查少于10份血清标本的临床实验室，IFA试验是理想的测定方法。 4.2.2.5IgG抗体-ELISA ELISA是刚地弓形虫IgG抗体筛查应用最广泛的试验。可溶性抗原包被于固相载体；患者血清与 2 GB/T30224—2013 抗原、酶标记抗人抗体（结合物）和底物孵育；分光光度计读取颜色变化。与DT和IFA试验结果比较， 敏感性高。有些ELISA试剂盒，血清热灭活可导致假阳性反应。 4.2.2.6IgG抗体-IgG亲合力 ELISA-IgG检测经改变测定模式或改良后可用于确定刚地弓形虫IgG抗体结合抗原的亲合力，并 已发现是一个判断慢性感染的最有用的指标，可排除急性感染。方法为同时检测双份血清标本，其中一 份经尿素处理分离低亲合力抗体。计算两个终点滴度比值，以百分数表示， 4.2.3刚地弓形虫IgM抗体检测 4.2.3.1IgM抗体-IFA IFA-IgM试验和IFA-IgG试验相似，只是采用了抗IgM的结合物。多数患者感染后1周内滴度升 高，6个月～9个月转为阴性。由于未去除血清标本中IgG，IFA-IgM试验可观察到类风湿因子引起假 阳性和刚地弓形虫IgG抗体封闭引起假阴性，敏感性较差。建议检测前处理标本以降低这些干扰因素 影响。 EAG 4.2.3.2IgM抗体-ELISA ELISA-IgM试验主要有捕获法和间接法两种类型。ELISA-IgM试验检测新生儿先天性刚地弓形 至18个月。这些试验不适于确定孕妇感染时间。 4.2.3.3IgM抗体-免疫吸附凝集试验（immuosorbentagglutination，ISAGA） IgM-ISAGA同时采用了ELISA中IgM捕获步骤和DA试验中完整虫体抗原，此试验用于先天性 感染的诊断比IFA-IgM和ELISA-IgM更敏感。缺点是ISAGA法比ELISA法可在更长的感染时间内 检测到IgM抗体，因此该试验不适于确定孕妇感染时间。 4.2.4刚地弓形虫IgA抗体检测 刚地弓形虫IgA抗体检测是判断新生儿感染的一个附加方法。所有怀疑先天性感染的新生儿应 同时检测血清IgA和IgM抗体，先天性感染的新生儿IgA抗体比IgM抗体更常见。 4.2.5刚地弓形虫IgE抗体检测 刚地弓形虫IgE抗体检测是确定急性感染的辅助指标。血清IgE抗体可持续数月，阴性结果并不 能排除急性感染。 5标本采集和处理 大多数实验室使用商品诊断试剂盒检测刚地弓形虫抗体。诊断试剂盒制造商必须明确检测的标本 类型。血清、血浆、脑脊液和眼部体液标本都可用于抗体和抗原检测。脑脊液和眼部体液应与同一时间 采集的血清标本平行检测。建议操作者遵循制造商的试剂说明书。标本4℃可储存数天，冷冻可储存 时间更长。除非运送时间超过1周或温度极高，标本可在常温下运送。 除抗体检测之外，其他试验采集标本前应与实验室联系以确保标本正确的采集和处理。 6安全预防措施 因不确定临床标本是否含有感染性物质，所以，所有标本都应当作有感染性对待，依据《实验室生物 3